小拟南芥chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

以野生资源小拟南芥(Arabidopsis pumila)chitinase基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阋读框架定向克隆于原核表达载体pET-30a( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组小拟南芥chitinase基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为40 KD.小拟南芥chitinase基因原核表达载体的成功构建和重组小拟南芥chitinase蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

拟南芥RPS14基因的克隆表达及功能初步研究

拟南芥RPS14(Ribosomal protein S14)是从拟南芥中分离出的一种核糖体蛋白,是核糖体40S亚基的组成成分,属于S11P核糖体蛋白家族,主要负责RNA转录后加工。提取拟南芥总RNA,用RT-PCR技术得到RPS14全长基因,经T-A克隆插入到pEASY-T3载体上。利用亚克隆法成功构建pGEX-6P-1-RPS14原核表达质粒。GST-RPS14融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,分子量约为43 kD。运用同样方法构建pET-28a-AK6原核表达质粒,获得大小约为26 kD的HIS-AK6融合蛋白。运用体外pull-down技术,并用SDS-PAGE和Western blot进行验证,证明拟南芥RPS14蛋白与AK6蛋白之间存在相互作用。因此,推测拟南芥的AK6与RPS14蛋白共同参与核酸代谢过程,影响RNA转录后加工,进而抑制拟南芥茎细胞的生长,使植株表现矮小特征。     

拟南芥中一种AtBAG4蛋白的抗体制备和特异性检测

以拟南芥AtBAG4的全长cDNA,构建pET-51780重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG可诱导融合蛋白高效表达,表达产物以可溶形式存在;经Ni-NTA层析柱分离纯化,可得到分子质量约为49kDa的PAGE纯蛋白。用纯化的融合蛋白pET-51780免疫家兔,可得到抗AtBAG4抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别原核系统内表达的抗原以及拟南芥自身的抗原。     

过表达海洋微生物宏基因组MbCSP提高转基因拟南芥的抗旱和耐寒性

干旱和低温是影响农作物生长发育的重要因素,培育转基因作物是解决此问题的有效途径。冷激蛋白（Cold Shock Proteins,CSPs）是一类高度保守的核酸结合蛋白,参与非生物胁迫应答等细胞生理活动,转CSP基因可增强作物抗逆能力。以海洋微生物宏基因组DNA为模板,采用锚定PCR的方法克隆得到了MbCSP基因,其ORF为216 bp,编码一个由71个氨基酸构成的蛋白;对其进行同源性分析,显示该氨基酸序列与EcCSPG、EcCSPA（大肠杆菌 Escherichia coli）,BsCspB（枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis）和BcCspA（蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus）等冷休克蛋白氨基酸序列同源性在60%~90%;对该氨基酸序列进行多重序列比对和系统发育树分析,结果发现MbCSP蛋白包含RNP1（KGFGFI）和RNP2（VFVHF）等CSP蛋白经典的保守结构域,其与EcCspG（大肠杆菌）和CmCspG、CmCspB（堆肥宏基因组）等生物的冷休克蛋白亲缘关系较近。为进一步探讨冷休克蛋白MbCSP的功能,构建了植物表达载体pTF101-MbCSP,采用花序浸染法转化拟南芥,经过除草剂筛选和PCR检测,获得转基因植株。进行半定量RT-PCR分析,选择表达量最高的阳性株系进行后续的生理检测。结果表明：在干旱胁迫及低温胁迫下,转基因拟南芥的生长状况明显优于野生型,其生物量显著高于野生型植株;转基因拟南芥的叶片相对含水量、叶绿素含量和超氧化物歧化酶活性均高于野生型拟南芥,而丙二醛含量则低于野生型拟南芥。上述结果表明,过表达海洋微生物宏基因组MbCSP能够提高转基因拟南芥的抗旱和耐寒能力,为培育转基因作物新品种奠定了基础。     

过量表达拟南芥AtGCS可以提高E.coli的重金属耐受性及富集能力(英文)北大核心CSCD

谷胱甘肽(GSH)是一类在生物体内广泛存在,并且是十分重要的重金属毒害保护剂之一。本研究将编码拟南芥γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因AtGCS(GSH合成的关键酶之一)转化到大肠杆菌(BL21)中,通过IPTG诱导过量表达TrxA-AtGCS融合蛋白来分析AtGCS在提高大肠杆菌重金属耐受性方面的作用。过量表达TrxA的大肠杆菌被用作对照。研究结果表明,在1 mmol.L-1Cd2+、Zn2+或Cu2+重金属胁迫下,过量表达TrxA-AtGCS的大肠杆菌细胞的生长状态要明显优于表达TrxA的对照细胞。同时,过量表达TrxA-AtGCS的大肠杆菌表现出超出对照细胞5倍以上的Cd2+、Zn2+和Cu2+累积量和4倍以上的GSH含量,其中,高于对照10倍的Cd2+富集量尤为明显。因而可以得出结论,拟南芥AtGCS的大量表达大大提升了大肠杆菌的谷胱甘肽含量,从而使GSH可以直接或间接地富集更多的重金属离子,进而提高了大肠杆菌对重金属逆境的抗性。     

拟南芥AtPUB18的亚细胞定位和酶活性及AtPUB18的表达

通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆到AtPUB18全长ORF。利用VectorNTI和MEGA 5.0对蛋白序列进行生物信息学分析结果显示,AtPUB18和AtPUB19蛋白序列相似性为74.9%,一致性为63.5%;构建AtPUB18启动子(1 974bp)融合GUS报告基因载体并转化拟南芥,组织化学染色分析显示,低温和干旱诱导后转基因植株中AtPUB18表达水平显著提高;构建AtPUB18与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的瞬时表达载体并转化原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现,AtPUB18-GFP融合蛋白分布在细胞核和细胞质中;构建AtPUB18与麦芽糖结合蛋白基因(MBP)融合表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白,纯化后的蛋白进行泛素连接酶活性检测结果显示,在小麦泛素激活酶E1和人泛素结合酶E2存在时,AtPUB18具有泛素连接酶活性。研究表明,AtPUB18是一个有功能的泛素连接酶,定位在细胞膜和细胞质中,可能参与拟南芥对非生物胁迫的响应。     

拟南芥VSP1硒代蛋白衍生物的制备和晶体生长

拟南芥VSPl蛋白是一种具有酸性磷酸酶活性的植物防御蛋白。为利用硒原子的反常散射获取VSPl蛋白晶体X射线衍射的相位信息,以质粒pET-22b为表达载体,大肠杆菌B834（DE3）为宿主茵,在含有硒代甲硫氨酸的M9培养基中诱导表达VSPl硒代蛋白衍生物。通过Ni-NTA亲和层析纯化的目的蛋白经SDS-PAGE检验,纯度在95％以上。通过优化VSPl母体蛋白晶体的生长条件,获得了可衍射的硒代蛋白晶体。     

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。     

副溶血性弧菌群体感应蛋白CqsA的原核表达

副溶血性孤菌CqsA是一种推测的信号分子合成酶,其合成的信号分子在群体感应系统中可能具有重要的调控作用.从副溶血性弧菌ATCC 17802中克隆cqsA基因,构建重组质粒pET22b-cqsA.测序后转化大肠杆菌B1L21进行IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达状况,并通过6× His-Tag进行Western blotting检测.结果显示,经0.6 mmol/L IPTG诱导4h,目的基因以包涵体形式高效表达,表达的融合蛋白大小约为49 kD,与理论值相符(437 aa).表明副溶血性弧菌群体感应蛋白CqsA在大肠杆菌中成功表达,为后续寻找副溶血性孤菌群体感应信号分子,进一步探索副溶血性弧菌群体感应系统提供参考.     

LmAPX基因在大肠杆菌和酵母菌中的表达研究

目的：研究枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因（ascorbate peroxidase,LmAPX）在原核中的表达和酶学特性以及在酵母菌中的抗氧化能力,为进一步研究逆境诱导的抗氧化胁迫的作用机理奠定理论基础。方法：将LmAPX转入大肠杆菌BL21中进行异源表达,采用 Ni²⁺亲和层析,纯化重组蛋白,并对不同温度和pH值下的酶活进行研究,Lineweaver-Burk双倒数作图法测定该酶的Km和Vmax值。将LmAPX转入酵母菌株W303中进行H₂O₂和NaCl氧化胁迫处理。结果：该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和6.5。当抗坏血酸（Ascorbic acid,AsA）浓度过量时,对H₂O₂的Km和Vmax分别是0.17±0.02 mmol/L和11.78±1.88 mmol/min·mg;当H₂O₂浓度过量时,对AsA的Km和Vmax分别是2.19±0.40 mmol/L和58.82±3.51 mmol/min·mg。含有LmAPX基因的酵母菌株,在半乳糖的诱导下在8 mmol/L H₂O₂和100 mmol/L NaCl的培养基上的生长都明显优于对照组。结论：LmAPX蛋白具有很好的抗氧化性和耐盐性。     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na /H 反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2·0mg/L6-BA、0·1mg/LIAA、1mg/LKT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株(转化频率为4·17%)。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na 及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K 的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

Synechocystis Fe superoxide dismutase gene confers oxidative stress tolerance to Escherichia coli

The superoxide dismutase (SOD) gene (slr 1516) from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 was cloned and overexpressed in Escherichia coli BL 21 (DE3) using the pET-20b(+) expression vector. E. coli cells transformed with pET-SOD overexpressed the protein in cytosol, upon induction by isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The recombinant protein was purified to near homogeneity by gel filtration and ion-exchange chromatography. The SOD activity of the recombinant protein was sensitive to hydrogen peroxide and sodium azide, confirming it to be FeSOD. The pET-FeSOD transformed E. coli showed significantly higher SOD activity and tolerance to paraquat-mediated growth inhibition compared to the empty vector transformed cells. Based on these results it is suggested that overexpression of FeSOD gene from a heterologous source like Synechocystis sp. PCC 6803 may provide protection to E. coli against superoxide radical-mediated oxidative stress mediated by paraquat.     

盐胁迫对拟南芥和盐芥莲座叶芥子油苷含量的影响

芥子油苷是十字花科植物中一类含氮、含硫的次生代谢产物,与其水解产物在植物防御功能中有重要意义且与环境因子关系密切。以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和盐生模式植物盐芥（Thellungiella halophila）为研究对象,系统地分析了盐胁迫下二者芥子油苷组成和含量的变化规律。拟南芥（生长4周）和盐芥（生长6周）叶片的芥子油苷组成在盐胁迫后没有改变。拟南芥的芥子油苷总量、脂肪族芥子油苷总量、吲哚族芥子油苷总量受盐胁迫的影响均不显著,而盐芥的则随盐胁迫增强先减少、后增加并高于对照水平。拟南芥脂肪族的3MSOP、5MSOP和吲哚族的4OHI3M、4MOI3M随盐胁迫增强而含量降低,而脂肪族的6MSOH、吲哚族的I3M以及盐芥脂肪族的3MSOP则随盐胁迫增强有含量增加的趋势。拟南芥脂肪族的8MSOO和吲哚族的1MOI3M,盐芥脂肪族的3MTP、Allyl、10MSD和吲哚族的4MOI3M,在盐胁迫下的含量变化与盐芥芥子油苷总量的变化趋势一致。     

香蕉条斑病毒云南河口分离物开放阅读框Ⅱ的原核表达、融合蛋白纯化及抗血清制备

以课题组保存的连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒河口分离物全基因组为模板,设计一对特异引物,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与pET32(b)载体共同双酶切及T4连接酶连接,得到重组载体pET32-ORF2。将获得的重组质粒pET32-ORF2转化表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞,得到表达BSV的ORFⅡ的工程菌。经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,超声波破碎后,获得的融合蛋白大多为包含体,但仍有少部分为可溶性蛋白可以进行后续的纯化步骤。将上述可溶性融合蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,获得纯度较高的融合蛋白。以纯化蛋白作为抗原免疫家兔,得到特异性抗血清。间接ELISA以及western blotting表明,所得抗血清效价和特异性都较高,可以用于检测。为BSV的快速检测以及一些相关后续理论研究工作奠定了一定基础。     

小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白的构建及多克隆抗体制备

目的：构建小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：将小鼠睾丸组织Vad1.2转录本行RT-PCR扩增,通过DNA重组技术插入克隆载体p ET15b,进行酶切及DNA序列分析。将表达载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）RIL感受态细胞,10 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白,通过10%SDS-PAGE、Western blotting及质谱分析进行鉴定。随后对重组Vad1.2蛋白进行纯化和进一步鉴定。最后,制备兔抗小鼠Vad1.2多克隆抗体,并通过Vad1.2-EGFP质粒转染GC-2spd（ts）细胞对其特异性进行验证。结果：大肠杆菌BL21（DE3）RIL细胞中诱导表达并纯化的小鼠Vad1.2重组蛋白构建正确并经Western blotting和质谱分析得到证实。所制备的多克隆抗体可特异性识别GC-2spd（ts）细胞中过表达的Vad1.2-EGFP融合蛋白。结论：成功构建小鼠Vad1.2重组蛋白,并制备多克隆抗体,为Vad1.2基因的进一步研究奠定了实验基础。     

坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因的原核表达与鉴定

通过PCR的方法从重组质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因(apcA),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7。将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定。结果显示:apcA全长486bp,表达的α亚基(apcA)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为19.7KD。0.5mmol/L的IPTG在37℃诱导6h时,apcA的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上。Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基。       

长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033的基因,利用大肠杆菌表达GST-BL0033融合蛋白并纯化。方法：以长双歧杆菌NCC2705株基因组为模板,PCR扩增BL0033基因,并将其插入pGEX-4T-1表达载体,转化至大肠杆菌DH5α;提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,并对表达条件进行摸索;用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂对可溶性GST-BL0033融合蛋白进行纯化。结果：PCR扩增的BL0033基因长度接近1000bp,与预期值一致;重组菌在IPTG浓度为0.05mmoL/L的条件下,于16℃诱导过夜后,SDS-PAGE分析可见可溶性表达条带,相对分子质量约60×103,与预期值一致;亲和纯化后,SDS-PAGE结果显示单一的表达条带。结论：克隆了BL0033蛋白的基因,并表达纯化了融合蛋白GST-BL0033,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705株BL0033蛋白功能奠定了基础。     

外源钙降低拟南芥幼苗盐害效应

用5mmol／L CaCl2喷叶后的拟南芥幼苗,在100mmol／L NaCl胁迫下,SOD、CAT和POD的活性以及叶绿素含量降低幅度明显低于对照,MDA含量增加幅度显著低于对照,由此表明钙与拟南芥幼苗盐害效应的降低有关。