拟南芥AtPUB18的亚细胞定位和酶活性及AtPUB18的表达

通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆到AtPUB18全长ORF。利用VectorNTI和MEGA 5.0对蛋白序列进行生物信息学分析结果显示,AtPUB18和AtPUB19蛋白序列相似性为74.9%,一致性为63.5%;构建AtPUB18启动子(1 974bp)融合GUS报告基因载体并转化拟南芥,组织化学染色分析显示,低温和干旱诱导后转基因植株中AtPUB18表达水平显著提高;构建AtPUB18与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的瞬时表达载体并转化原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现,AtPUB18-GFP融合蛋白分布在细胞核和细胞质中;构建AtPUB18与麦芽糖结合蛋白基因(MBP)融合表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白,纯化后的蛋白进行泛素连接酶活性检测结果显示,在小麦泛素激活酶E1和人泛素结合酶E2存在时,AtPUB18具有泛素连接酶活性。研究表明,AtPUB18是一个有功能的泛素连接酶,定位在细胞膜和细胞质中,可能参与拟南芥对非生物胁迫的响应。     

棉花微管结合蛋白基因GhCLASP1的克隆与表达分析

CLASP蛋白(CLASPs)是一种能够特异地与微管结合,参与调节微管结构与功能的微管结合蛋白(MAPs),在植物细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。该研究利用电子克隆结合RT-PCR技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个CLASP基因,命名为GhCLASP1(NCBI登录号为KP742966)。序列分析显示,GhCLASP1属于CLASP基因家族,开放阅读框长度为4 188bp,编码含1 395个氨基酸残基的蛋白;GhCLASP1蛋白含有1个HEAT重复结构域和2个CLASP-N端结构域。进化分析表明,GhCLASP1与可可树(Theobroma cacao)CLASP蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,GhCLASP1在棉花的根、茎、叶、花及纤维发育的不同时期均有表达,且GhCLASP1基因表达量最大值出现在纤维发育次生壁加厚期(开花后27d),推测GhCLASP1基因可能对棉花纤维次生壁的形成起着重要的作用。利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达系统对GhCLASP1基因编码的蛋白进行亚细胞定位结果显示,GhCLASP1蛋白定位在细胞膜上。上述结果为进一步研究CLASP基因在棉花中的功能奠定了基础。     

陆地棉PIP亚家族基因的克隆及表达特征分析

该研究以陆地棉苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)氨基酸序列为探针,利用Blastp从陆地棉基因组数据库中发现了6个同源性较高的基因。根据6个基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从陆地棉纤维细胞中克隆出了这6个基因的全长cDNA序列,分别命名为GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2。多重序列比对和进化树分析发现,6个蛋白均含有PIP类型蛋白的所有保守性基序和活性残基,属于PIP亚家族。实时荧光定量PCR结果显示,除GhPLR1之外其他5个PIP亚家族基因均在纤维细胞中优势或特异表达;在纤维发育过程中,GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3和GhIFR的表达均表现为先上升后下降,GhPCBER1和GhPCBER2在花后21d表达量达到最高,GhPCBER3和GhIFR在花后18d达到最高,GhPLR1和GhPLR2在纤维中的表达量呈持续上升趋势。根据基因的表达特征,推测PIP亚家族可能在棉纤维的发育过程中发挥着重要作用。