油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

高山离子芥MAP激酶基因CbMAPK3的克隆

从高山离子芥中克隆得到了一种新的MAPK基因的cDNACbMAPK3,全长1419bp,其中包括1110bp的开放阅读框、91bp的5＇非翻译区（5＇UTR）和218bp的3＇非翻译区（3＇UTR）。CbMAPK3基因编码369个氨基酸的蛋白质,分子量为42.5kDa,等电点为5.79,含有MAP激酶所具有的11个保守序列区以及MAP激酶的磷酸化位点TEY基序。CbMAPK3蛋白与响应环境胁迫有关的植物MAPK亚类有很高的同源性。半定量分析表明,该基因表达受低温胁迫诱导。     

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138bp,其中,5’非翻译（UTR）区128bp,3＇非翻译区212bp,开放阅读框（ORF）全长798bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．58kDa,理论等电点（pI）为9．68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52％,与葡萄7h序列同源性为76％,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

西伯利亚蓼中PsMnSOD基因的克隆及其抗逆性检测

采用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了锰超氧化物歧化酶基因PsMnSOD的cDNA（GenBank登录号FJ848572）。长为792bp的PsMnSODcDNA序列含有编码234个氨基酸的705bp的开放读码框、57bp的5＇非翻译区和30bp的3＇非翻译区。构建了PsMnSOD基因的酵母表达载体pYES2-PsMnSOD并将其转化到野生型酵母菌株中。分析PsMnSOD基因在酵母中的表达对酵母SOD酶活性的影响及其对盐胁迫、PEG胁迫、高温和低温胁迫下抗逆性影响的结果表明,PsMnSOD基因在酵母中表达后酵母SOD酶活性提高,酵母对盐渍、PEG、高温和低温等非生物胁迫的抗逆性也增强。     

3株肠道病毒71型毒株的全基因组序列分析

目的：对获得的3株肠道病毒71（EV71）型毒株进行全基因组序列测定,并对其进化特点及分型进行初步分析。方法：提取病毒RNA,反转录得到eDNA,PCR分段扩增覆盖病毒全长序列的6个重叠片段（不包括多聚腺苷酸尾）;用软件将3株EV71的备片段序列进行拼接、编辑和校正,随后进行氨基酸翻译及序列比较;用MEGA4.1软件构建系统进化树。结果：获得了3株EV71的全长序列：GDV103株基因组全长7404 nt,包括741bp的5’端非编码区（UTR）、6582bp的病毒基因组编码区（ORF）及81bp的3’UTR;安徽株（Anhui2007）基因组全长7405nt,包括742bp的5＇UTR、6582bp的ORF及81bp的3＇UTR;VR1432株基因组全长7408nt,包括743bp的5’UTR、6582bp的ORF及83bp的3’UTR长。经同源性比对和进化树分析,证实GDV103和安徽株EV71属于C基因型的C4基因亚型。而VR1432株则属于C基因型的C2基因亚型。结论：获得了3株EV71的全长基因组序列,并进一步探讨了其型别,为下一步的干扰素保护宴,哈重定了基础．     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个新的金属硫蛋白基因LbMT2全长cDNA序列。该基因全长518 bp, 其中5′非翻译区(UTR)64 bp, 3′非翻译区205 bp, 开放阅读框(ORF)249 bp, 编码由82个氨基酸组成的蛋白质, 编码蛋白的分子量为8.1 kDa, 理论等电点(pI)为4.72。利用实时定量PCR方法研究了二色补血草在CuSO4、CdCl2、NaCl、低温和PEG胁迫下不同时间该基因的表达模式。结果表明, CuSO4、CdCl2、NaCl和低温处理均能诱导LbMT2基因在二色补血草的根和叶中的表达, 而PEG处理则抑制了LbMT2在根和叶中的表达。构建LbMT2基因的原核表达载体pGEX-LbMT2, 通过IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中融合表达, SDS-PAGE 电泳获得35 kDa 的蛋白条带, 大小与预期相符。     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

苎麻小分子G蛋白Racl基因的克隆及表达分析

植物Rac是植物中特有的小分子G蛋白,我们从苎麻转录组中获得一个小分子G蛋白基因eDNA,．5部分序列,设计引物后采用RT-PCR结合RACE技术克隆了该基因的cDNA。序列分析表明,所克隆的RaclcDNA全长为l043bp,包括594bp开放阅读框、214bp的3’端非编码区和235bp的5’端非编码区,能编码一个197氨基酸的推导蛋白。该蛋白包含G蛋白典型的效应因子结合位点、GTP／GDP结合位点和碱性氨基酸区,c末端具有保守的异戊烯基化位,CSIL。采用半定量RT-PCR分析了该基因在5个苎麻品种及不同组织器官中的表达情况,结果表明Racl基因在苎麻根、茎、叶中均有表达,其中在叶中的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种中,Racl基因的表达量存在明显差异。木质素含量高的品种具有较高的Racl基因表达,表明该基因可能在苎麻木质素合成过程中发挥作用。     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

粘虫核糖体蛋白S7cDNA的克隆和表达分析

运用RT—PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimnaseparata（Walker）核糖体蛋白s7基因（RPS7）的全长eDNA序列（GenBank登录号：JN582331）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长eDNA序列为762bp,包括5’非编码区32bp和3’非编码区67bp。其开放阅读框（573bp）编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21．924ku,等电点为9．82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96．8％-98．2％高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析

WRKY转录因子普遍存在于植物体内,在植物的抗病防御反应中起重要作用。本实验基于漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）中编码WRKY转录因子的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的脓Ky基因的全长cDNA序列,命名为JsWRKY1（KJ170895）。JsWRKY1的cDNA全长为1012bp,含有564bp的开放阅读框,154bp 5’-非翻译区以及294bp的3＇-非翻译区,编码具有187个氨基酸的蛋白质。JsWRKY1编码的氨基酸序列与已知植物WRKY家族成员间的同源性和聚类分析表明JsWRKY1与来源于可可树（Theobroma cacao）和大豆（Glycinemax）中的wRKY相似性较高,属于IIc类wRKY。qRT-PCR分析结果显示,信号分子水杨酸、茉莉酸、H2O2和乙烯处理可以不同程度地诱导漾濞大泡核桃叶片中JsWRKY1的表达。此外,接种胶孢炭疽菌后JsWRKY1的表达量迅速上升,在接种后4h时达到最高水平,之后表达量逐渐下降,暗示JsWRKY1参与漾濞大泡核桃抗胶孢炭疽菌的防卫反应。     

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白（pathogenesis related protein, PR） 10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）编码PR10的EST（expressed sequence tag）序列设计引物,利用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长cDNA序列,并命名为JsPR10-1。JsPR10-1全长cDNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5′-非编码区以及219 bp 3′-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。JsPR10-1编码的蛋白质与栎树（Quercus suber）、欧洲山毛榉（Fagus sylvatica）以及欧洲板栗（Castanea sativa）的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导JsPR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）后,JsPR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明JsPR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。