酵母pro 2基因转化紫云英的研究

用外植体一农杆菌共培养法将酵母脯氨酸合成酶基因2(pro 2)导入豆科牧草紫云英,获得转基因植株。Southern blot分析检测到转化植株基因组中存在外源DNA的同源顺序,证明酵母pro 2基因已整合到紫云英细胞基因组中。转化植株具有强的NPT Ⅱ酶活性,而对照植株呈阴性反应。在含0.5%NaCl的培养基上,紫云英植株内游离脯氨酸含量增高,一些转化植株叶片内游离脯氨酸含量显著高于对照,而且耐盐性有所提高。转化植株移栽到土壤中开花结实,收获到R_1代种子。     

牧草植物鹰嘴紫云英的遗传转化

鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)是一种优良的豆科牧草。 15kD玉米醇溶蛋白是一种富硫的蛋白质,含硫氨基酸占总氨基酸量的15.63%。本文通过农杆菌(Agrobacterium)的介导将rbcS启动子调控的15kD玉米醇溶蛋白基因的嵌合质粒导入鹰嘴紫云英,得到转化的植株。这些植株具有NPTⅡ酶活性,抗卡那霉素。Southern blot分子杂交表明,15kD玉米醇溶五白基因已转化并整合入鹰嘴紫云英的核基因组中。     

干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究

以成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,将诱导型启动子rd29A驱动的拟南芥DREB1A基因导入粳型光温敏核不育系水稻4008S,共获得67株再生苗.再生苗经0.75 mg/L除草剂草铵膦涂布筛选,有62株再生苗表现出对草铵膦抗性.PCR检测抗性苗中DREB1A基因,结果全为阳性.挑选部分进行Southem检测.结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中.在干旱胁迫下,转基因水稻当代(T1代)植株的电导率显著低于非转基因对照植株(P＜0.05),脯氨酸含量显著高于对照植株(P＜0.05),证明DREBIA基因能提高水稻对干旱胁迫的耐受性.     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na /H 反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2·0mg/L6-BA、0·1mg/LIAA、1mg/LKT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株(转化频率为4·17%)。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na 及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K 的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因(afp)导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因作为供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４·４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃．说明ａｆｐ基因已整合到转化番茄基因组并获得表达     

拟南芥ICE1基因转化水稻的进一步研究

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将由启动子（35S和rd29A）调控的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传;抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照;脯氨酸含量测定结果表明,低温处理后T1代植株脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照;上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。     

太谷核不育小麦花药内游离脯氨酸和总氨基酸含量的变化及其与育性的关系

本文对显性单基因控制的太谷核不育小麦不同发育阶段的可育株和不育株的花药及雌蕊内游离肺氨酸和游离总氨基酸的含量进行了分析。结果表明:(1)在小孢子母细胞减数分裂期,不同育性花药之间游离脯氨酸的含量无明显差异,且含量较低。(2)在小孢子单核初期,可育花药内游离脯氨酸的含量显著高于不育花药,是不育花药的7倍,比减数分裂期增加20倍,高达其干重的1.65％,占其游离总氨基酸的50％。(3)在雌蕊中,游离脯氨酸的含量远远低于花药,不同育性植株之间差异不很明显。(4)关于游离总氨基酸的含量,在花药中减数分裂期,不同育性植株之间无明显差异;在小孢子单核初期,可育株高于不育株。在雌蕊中,相应于小孢子单核初期时,可育株稍高于不育株,受精后迅速趋于一致,但整个变化幅度不大。     

拟南芥ICEl基因转化水稻的进一步研究

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将由启动子(35S和rd29A)调控的拟南芥ICEI基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中.潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传;抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照;脯氨酸含量测定结果表明,低温处理后T1代植株脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照;上述结果表明,转ICEl水稻提高了抗寒能力.     

缙云山四川大头茶花粉游离脯氨酸含量与生殖产量特征研究

四川大头茶（Gordonia acuminata）是缙云山亚热带常绿阔叶林的优势树种之一,在缙云山的很多群落类型中均有分布。对缙云山四川大头茶的花粉游离脯氨酸含量的影响因素以及花粉游离脯氨酸含量与四川大头茶生殖产量之间的关系进行了研究。研究表明,缙云山四川大头茶的花粉游离脯氨酸含量不受植株年龄大小的影响,但与植株所处的群落类型有很大关系。常绿阔叶中四川大头茶的花粉游离脯氨酸含量最高,四川大头茶纯林中次之,针阔混交林中四川大头茶花粉游离脯氨酸含量最低。四川大头茶花蕾产量和果实产量随植株年龄的增大而增大,但座果率与植株年龄大小无关。对花粉游离脯氨酸含量与花蕾产量、果实产量和座果率之间的相关关系分析,花粉游离脯氨酸含量与花蕾产量不具有相关关系,与果实产量具有正相关关系,与座果率具有极显著正相关关系。这证实了与受精作用无关的生殖产量特征不受花粉游离脯氨酸含量影响,而与受精作用有关的生殖产量特征将受花粉游脯氨酸含量影响的研究假设。由于与花粉游离脯氨酸含量呈极显著正相关关系,座果率具有和花粉游离脯氨酸含量一样的群落间变化模式。     

莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达与活性分析

采用RT-PCR方法克隆到莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因lyd(l)5,与毕赤酵母表达载体pPIC3.5K连接,电击法转化毕赤酵母GS115.转化子经高浓度G418筛选出高抗性重组子,经PCR鉴定目的基因已整合入毕赤酵母基因组中.甲醇诱导表达,RT-PCR检测表明莱茵表藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中得到了表达;毕赤酵母总脂肪酸甲酯经气相色谱(GC)分析结果显示亚油酸的含量明显降低,而α-亚麻酸的含量有所提高.     

NaCl胁迫下海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)植株内游离脯氨酸的合成积累途径

以海马齿(Sesuvium portulacastrum L.)为材料,测定了在6个NaCl胁迫水平上(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol· L-1)的植株内游离脯氨酸的含量及其δ-OAT、PSCS、POD、SOD等酶的活性.结果表明:在NaCl胁迫下,海马齿植株内游离脯氨酸积累量比CK显著地增多了14.5％～33.5％,δ-OAT和P5CS活性分别比对照(CK)增强3.1％～10.1％和26.7％ ～46.1％,因此,在NaCl胁迫下海马齿植株内游离脯氨酸合成积累的两个途径均被启动和发生合成积累作用,并表现出以Glu→Pro途径为主,Orn→Pro途径为辅;在5个NaCl胁迫水平上,海马齿植株内游离脯氨酸有显著的积累效应,在0.6 mol·L-1处理水平时达到积累量的高峰值.同时,δ-OAT、P5CS、POD、SOD等酶的活性呈现出与游离脯氨酸积累量有大致相同的变化趋势.     

外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究

以冬小麦品种8901、5-98、99-92和104等品种的幼穗和幼胚为材料,用基因枪转化含逆境诱导转录因子DREB和bar基因的质粒pBAC128F（7024bp）。经筛选与植株再生,共获得70多个转基因小麦植株及其后代株系。转基因株系经PCR分析和RNA点杂交检测,结果表明外源转录因子DREB基因已稳定整合到转基因植株及其后代株系中,并且在部分后代株系中获得了表达。叶片脯氨酸含量测定表明,有16个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比,增加相当显著,其中10个株系的脯氨酸含量在1100μg/g以上,比对照提高了2倍多。室内抗旱模拟实验表明,转基因株系停止浇水15d后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水10d后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。研究表明,利用逆境诱导型启动子（rd29B）来增强外源DREB基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性。     

利用P5CS基因转化白三叶的研究

为了培育抗旱白三叶,构建了植物表达载体pBPC-P5CS,利用基因枪法转化白三叶的愈伤组织,PCR检测和Southern blot鉴定证实白三叶中已导入P5CS基因。对转P5CS基因白三叶植株的不同抗旱指标进行了分析。结果表明,与对照相比,转P5CS基因株系的抗旱能力得到了较大的提高。干旱胁迫下,与对照相比,转P5CS基因植株的脯氨酸含量和相对含水量分别比对照高20.0%-21.2%和5.6%-8.5%。     

抗羟脯氨酸水稻变异系的筛选及其特性的研究

利用Hyp反复筛选经EMS处理的水稻愈伤组织,得到4个抗性细胞系。它们的游离脯氨酸含量高于对照2—25倍。Hyp(2 mmol/L)和NaCl(1%)胁迫对M_1、M_2变异系γ-谷氨酰磷酸合成活力及游离脯氨酸积累的影响呈一定的正相关性。变异系在0.8%,15NaCl 培养基中分化出植株。与对照相比,各变异系在愈伤组织、植株水平上均表现较强的耐盐性,且与游离脯氨酸的积累量呈正相关。     

环己亚胺对盐诱导游离脯氨酸累积的影响

环己亚胺(CHX)单独作用会增加高梁苗中游离脯氨酸的含量,原因可能有:一是CHX抑制了根的正常吸收功能,导致植株失水,游离脯氨酸增加;二是CHX抑制了蛋白质合成,使总的游离氨基酸累积,从而也表现出游离脯氨酸含量的增加,后者可能更为主要。为此,用CHX研究与脯氨酸合成有关的基因活性化或表达时,一定要考虑CHX单独的作用。NaCl诱导的游离脯氨酸的累积可被CHX处理所抑制。在NaCl处理2～4h内加CHX后,抑制效果几乎可达到100％,以后随CHX处理的时间越长,其抑制作用越小。     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、1mg/L KT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株（转化频率为4.17%）。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na⁺及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K⁺的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、1mg/L KT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株（转化频率为4.17%）。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na⁺及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K⁺的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

旱后复水对东亚砂藓生理生化指标的影响

对经长期干旱的东亚砂藓（Racomitrium japonicum）材料按不同时间梯度复水处理,并测定游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化物酶（POD）活性等4项生理指标。结果表明,经长期干旱的东亚砂藓4项生理指标在复水后2d内恢复到对照水平,而在复水过程中变化趋势有所不同：可溶性蛋白含量经长期干旱后在植物体内积累,SOD活性较高,在复水过程中与游离脯氨酸含量变化趋势一致,呈现升高后降低的波动状态恢复到对照水平;而游离脯氨酸含量和POD活性经长期干旱后和对照一致,在复水过程中POD活性迅速升高而后很快恢复到对照水平。这4种生理指标从一定程度上反应了耐旱东亚砂藓具有不同于其它植物的旱后复水的特殊生理机制。     

甘蓝转生长素基因系自交后代叶球和根系的发育特征

甘蓝转生长素基因系Ｇ４３２５的基因组内插入有发根农杆菌ｐＲｉ质粒上的生长素合成酶基因。该转基因自交后,其Ｍ２代的植株仍保留异常的形态和生理特征。它们与未转化的正常植株相比,结球期提前,叶球变小,紧实度增加,外叶趋向松散的抱合,侧根数增多;腋芽扦插时不定根发生早而多,成活率显著高于对照;     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。