人类基因组分析中新的分子工具-YAC

通常用于ＤＮＡ克隆的载体,如质粒、λ噬菌体载体ｃｏｓ质粒（ｃｏｓｍｉｄ）等,其容量５０ｋｂ,对于多数基因或某些小的基因簇,这个容量是足够的。但对于人类基因组研究和某些大基因的克隆,这些载体就有相当的局限性。例如人类第Ⅷ因子基因编码凝血因子,它的缺陷可...     

基因疫苗--防治疾病的新武器

基因疫苗(ｇｅｎｅｖａｃｃｉｎｅ)又名ＤＮＡ疫苗(ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ)。基因疫苗常被称作“裸”ＤＮＡ疫苗。它不含肽、蛋白质或病毒载体,只是由来源于病原体的一个抗原编码基因及作为其载体的质粒ＤＮＡ组成。这段抗原编码基因可在活体细胞中控制合成抗原蛋白,从而引起免疫反应。它所合成的抗原蛋白类似于亚单位疫苗,区别只在于基因疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生的。1990年,Ｗｏｌｆｆ等发现,对肌肉直接进行ＤＮＡ注射能够得到表达的蛋白产物,并指出,这可能为发展疫苗提供新的途径。1993年,Ｕｌｍｅｒ等将携带流感病毒核心蛋白编…     

转移DNA

农杆菌能够将其环状质粒上的一段转移ＤＮＡ(ｔｒａｎｓｆｅｒＤＮＡ ,Ｔ ＤＮＡ)转移并整合到受体细胞的基因组中 ,并使之携带的基因在受体细胞中表达。利用这种天然载体转化系统 ,除了可以在细菌间进行接合转移外 ,还可以向真菌、放线菌等低等真核生物和许多高等植物基因组转移[1] 。利用人工构建的转移复合物可以将ＤＮＡ转运到哺乳动物的细胞核中[2 ] 。虽然不同农杆菌质粒ＤＮＡ同源性有较大差异 ,但仍有一些共有的保守区段 ,如Ｔ ＤＮＡ区、Ｖｉｒ区、质粒复制起始区、质粒接合转移毒性区等。其中Ｔ ＤＮＡ区和Ｖｉｒ区是与Ｔ ＤＮＡ…     

内切酶SCaI对不同纯度质粒的酶解效率探讨

限制性内切酶ＳＣａＩ适用于多种质粒载体,尤其是融合蛋白表达载体,ｐＧＥＸ系统,因它具有二个ＳＣａＩ酶切位点,因此用ＳＣａＩ酶解图谱鉴定以ｐＧＥＸ系统为载体的重组子甚为便捷。简便碱裂解法提取重组ＤＮＡ省时,省耗。本文探讨了ＳＣａＩ对用常规和简便两种碱裂解法提取的重组ＤＮＡ的酶解效率。结果表明：（１）简便碱裂解法抽提的重组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ等限制性内切酶酶解,可以获     

一种快速、简便、高效cDNA合成及克隆策略

以鱼呼肠孤病毒双链ＲＮＡ为模板,建立一种快速、简便、高效的ｃＤＮＡ合成及克隆策略。在一定量模板条件下,采用随机六聚体为引物合成ｃＤＮＡ第一链。以退火方式形成双链ｃＤＮＡ,直接通过琼脂糖凝胶电泳检测其ｃＤＮＡ合成产量。双链ｃＤＮＡ经两端补齐后,平头连接于具有阳性选择标记的载体中,以高效电转化的方式进行快速克隆。     

cDNA文库构建策略

随着ｃＤＮＡ文库应用的日益广泛,其构建方法也有了很大改进和提高。获得完整和均一的ｍＲＮＡ是构建成功的基础,合成ｃＤＮＡ时可根据不同目的选择相应的反转录酶和方法,用于构建的载体也由质粒发展到噬菌粒并各有其利弊,双链ｃＤＮＡ克隆前应视连接方案进行末端修饰和分级分离,克隆时则需把握ｃＤＮＡ和载体的比例。     

IL—2重组杆状病毒载体的构建及表达

将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮ－ＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经限制性酶切和ＤＮＡ杂交筛选、鉴定出重组转移载体ｐＶＬ１３９２－ＩＬ２。重组载体通过在昆虫细胞内共转染将ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移到野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ中。经３２Ｐ标记探针鉴定出重组病毒Ａｃ１３９２－ＩＬ２。用重组病毒感染昆虫细胞,结果表达产物有明显刺激ＣＴＬＬ细胞生长,［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－２活性为１５００ＩＵ／ｍ１。     

从9q34肌氨酸血症位点克隆人二甲基甘氨酸脱氢酶样基因

将鼠二甲基甘氨脱氨酶样基因（ｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－ｌｉｋｅｇｅｎｅ）的部分 编码序列对ＥＳＴ数据库进行同源性分析,得到与其显著相似的１个人ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋＨ２８８５６）（３３０ｂｐ）。此ＥＳＴ与９ｑ３４上的２个ｇＤＮＡ的文库中载体臂上上两端的引物ＰＣＲ,在所得ｃＤＮＡ上再设计引物与ｃＤＮＡ文库载体臂上引物ＰＣＲ,最终在肝ｃＤＮＡ文库获得１个完整编码区的ｃＤＮ     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

cIts857基因的克隆,修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ克隆出９９０ｂｐ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架Ｉｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体,用于表达人工合成的牛生长激素、人干扰素－γ△Ｃ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。     

基因转移的DNA病毒方法

在基因治疗中,作为基因转移的载体,迄今几乎都用逆转录病毒,但是在某些情况下,ＤＮＡ病毒作为载体具有明显的优越性,本对腺相关病毒、腺病毒和疱疹病毒作为外源基因载体进行了简要的讨论。     

DNA修复的分子机制

ＤＮＡ是遗传信息的载体,需要有极高的保真度,这不仅有赖于完善的复制体系,而且还需要有能纠正已存在错误的修复系统。对于不同的ＤＮＡ损伤,生物体内存在许多不同的修复系统。本文介绍三种主要修复系统即核苷酸切割修复,错配修复及转录偶联修复的分子机制,深入研究ＤＮＡ修复作用对了解某些癌症成因及细胞衰老等过程有重要意义 。     

DNA修复的分子机制

ＤＮＡ是遗传信息的载体,需要有极高的保真度,这不仅有赖于完善的复制体系,而且还需要有能纠正已存在的错误的修复系统。对于不同的ＤＮＡ损伤,生物体内存在许多不同的修复系统。本文介绍三种主要修复系统即核苷酸切割修复,错配修复及转录偶联修复的分子机制,深入研究ＤＮＡ修复作用对了解某些癌症成因及细胞衰老等过程有重要意义。     

DNA—处理的精子作为基因转移载体

继１９８９年首次报道成功地利用精细胞作为载体把ＤＮＡ转入小鼠胚胎及随后ＤＮＡ整合入小鼠基因组后,现又取得了一些进展和新的发现。据报道,ＤＮＡ可结合或掺入不同种类的动物和昆虫的精子中,包括小鼠、猪、山羊、绵羊、牛、鸡、鲤鱼、海胆、蜜蜂和丽蝇类等。通常,人们用脂质体或电激法来促进ＤＮＡ进入精细胞。这些研究出现的一个意外结果是质粒转基因作为染色体外遗传因子的持久性。１９９５年,澳大利亚研究人员在《动物生物技术》杂志上曾发表了一篇用ＤＮＡ处理的精子人工授精生产转基因牛的报道。经Ｓｏｕｔｈｅｍ印迹分析表明…     

应用cDNA文库快速构建法克隆高粱肌动蛋白基因

取生长一周的高粱嫩叶为材料,按照ｃＤＮＡ库快速构建法,用λｇｔ１０为载体成功地获得了含有２×１０＾０６人重组噬菌体的ｃＤＮＡ库。以水稻ＲＡｃｌ ｃＤＮＡ为探针,经噬菌体原位杂交筛选出两个阳性克隆片段,并对其中一个进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定。然后将重组体中含有的ｃＤＮＡ片段亚克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ－载体上测序。     

生物芯片技术及其应用

生物芯片是指包被在固相载体上的高密度ＤＮＡ、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵,它是微电子学和分子生物学结合产生的新技术。该技术被评为１９９８年度世界十大科技进展之一。本文讨论了生物芯片技术的发展、技术参数、相关仪器的发展和在ＤＮＡ序列测定、基因表达分析、基因分型、基因多态性分析、疾病的诊断、突变分析、药物筛选和微生物的鉴定等方面的应用。     

提高DNA疫苗免疫效果的策略

近年来,ＤＮＡ疫苗的研究进展迅速,已在多种病毒、细菌、寄生虫病、肿瘤、过敏性疾病及免疫病理性疾病的防治研究中取得了令人鼓舞的成果,进一步提高ＤＮＡ疫苗的免疫效果是今后努力的方向。当前在这方面主要的策略有：构建真核表达载体时,选择合适的启动子;质粒基本骨架中插入免疫刺激序列（ＩＳＳ）或选择具有免疫增强作用的载体;细胞因子基因与外源基因共表达或共接种以提高外源基因编码抗原诱导的免疫反应。此外,质粒ＤＮＡ的接种剂量和途径也可影响免疫反应效果。     

小鼠白细胞介素12双顺反子真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

克隆小鼠白细胞介素１２（ＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,并构建同时含ｍＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５ｃＤＮＡ的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达．白细胞介素１２是由巨噬细胞,树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子,对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用．利用脂多糖（１００ｐｇ／ｍｌ）和小鼠重组干扰素（ＩＦＮ－γ５００Ｕ／ｍｌ）体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞,从中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素１２（ｍＩＬ－１２）ｐ４０及ｐ３５全长ｃＤ－ＮＡ．ＰＣＲ产物经酶切后,分别克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体中,序列测定结果与文献报道序列一致．然后利用脊髓灰质炎（Ｐｏｌｉｏ）病毒内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）连接ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ,亚克隆至ｐｃＤＮＡ３载体中,构建成含ｍＩＬ－１２ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ双顺反子真核表达载体,即ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２,ｐ４０及ｐ３５ｃＤＮＡ同时受ｐｃＤＮＡ３中ｈＣＭＶ启动子驱动,将ｐ４０及ｐ３５转录至同一ｍＲ－ＮＡ上．通过ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ将ｐｃＤＮＡ３／ｍＩＬ－１２转染ＣＯＳ－７细胞,７２ｈ收集培养上清,测定ｍ     

汉滩病毒S基因及其5‘端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义,为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物,用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ）,用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中,成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体,并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率,目　的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。     

我国农业生物基因工程安全评价的现状、问题与建议

我国农业生物基因工程安全评价的现状、问题与建议吕建秋雷茂良石燕泉程金根（华南农业大学广州５１０６４２）（农业部科技质标司北京１０００２６）农业生物基因工程是指利用载体系统的重组ＤＮＡ技术及利用物理、化学和生物等方法把重组ＤＮＡ导入农业生物体内的技...