细菌遗传学

质　　粒质粒编码的特性如前所述 ,质粒是环状的染色体外遗传因子 ,它可编码多种遗传信息 ,包括通过接合而自我转移 (ｓｅｌｆ-ｔｒａｎｓｆｅｒ)至其他细胞的信息。并非所有的质粒都能转移它们自己 :非接合(ｎｏｎ -ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ)类质粒既不能编码供体的菌毛也不能进行转移。不过 ,它们可被存在于同一供体细胞内的其他接合性质粒所移动 (ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ)。除了这种任选性的转移能力之外 ,所有的细菌质粒都含有其为在细胞分裂时自我复制及分离进入子细胞所必需的基本遗传信息。质粒似乎普遍存在于细菌之中 ;许多质粒编码以下…     

RP4质粒及其带动的硫杆菌重组质粒psDt125在氧化硫硫杆菌中的接合转移

本实验选择了一种大肠杆菌(E.coli)和氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)均能生长的接合培养基。以大肠杆菌E.coli C600(RP4)为供体,以氧化硫硫杆菌T.t-3为受体,通过接合,直接将RP4质粒转移到氧化硫硫杆菌中,其Km~r,Tc~r基因得到表达,但Ap~r基因不表达。再将RP4质粒反向接合转移到E.coliHB101上,其三个抗性基因均表达。并且利用RP4质粒的带动将硫杆菌重组质粒psDt125直接转入氧化硫硫杆菌,其Cm~r基因表达。从而为氧化硫硫杆菌的基因工程改造提供了一条简便可行的遗传信息转移途径。     

变铅青链霉菌内源线性质粒接合转移必需功能区的鉴定

通常细菌间环型质粒在接合转移过程中,单链质粒DNA在质粒内部“oriT”接合转移起始位点发生缺刻.随后,打开的单链质粒DNA通过细胞膜的Ⅳ型分泌系统转移到受体菌中.但是,链霉菌中的接合型线型质粒带有游离3′端,5′端与末端蛋白结合,因而不能以细胞-细胞间方式转移单链缺刻DNA.报道了变铅青链霉菌线型质粒SLP2衍生的环型质粒,与SLP2一样可以高频高效接合转移,并鉴定了接合转移功能区.质粒有效的接合转移功能区包含6个共转录的基因,分别编码一个Tra样的DNA转移酶、胞壁水解酶、2个膜蛋白(可以与ATP结合蛋白相互作用)和一个功能未知的蛋白质.从SalⅠR-/M-向SalⅠR/M宿主转移的质粒频率下降表明,线型和环型的质粒都是以双链的形式转移的.上述研究结果表明SLP2衍生的线型质粒和环型质粒以相似的与细胞膜/胞壁功能相关的机理进行接合转移.     

苏云金杆菌毒性质粒在蜡状芽胞杆菌群间的水平转移

以苏云金芽胞杆菌KT0为质粒供体菌,在液体环境中与蜡状芽胞杆菌组成员菌(Bacillus cereus sensu lato group strains)发生接合转移。对所筛选到的接合转移子进行了质粒稳定性检测、PCR验证以及供、受体菌染色体背景RAPD图谱分析。不同培养基中质粒转移率数据表明:在人工LB培养基及灭菌牛乳中,质粒pHT73均能以不同频率转移至蜡状芽胞杆菌组受体菌,并且在牛乳中转移活性更高,最高可这4.8×10~(-4)cfu/ donor。获得质粒的受体菌同时具备了质粒所编码基因功能,产生其编码的杀虫晶体蛋白。SDS-PAGE电泳和光镜结果显示转化菌在得到外源质粒pHT73后,能产生由cry1Ac基因编码的130 ku蛋白Cry1Ac,在芽胞期能形成稳定的菱形晶体。     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。     

一株红球菌(Rhodococcus sp.)二噁英降解质粒的稳定性与接合转移特性

【目的】考察一株红球菌Rhodococcus sp.strain p52中的二噁英降解质粒pDF01(170 kb)和pDF02(242 kb)的稳定性和接合转移特性。【方法】在无选择压力的条件下对菌株p52进行连续传代培养,考察质粒pDF01、pDF02的丢失;以菌株p52为供体菌,以不同种属的菌株作受体菌,通过平板接合实验探讨质粒pDF01、pDF02接合转移的受体菌范围以及接合转移频率,利用菌落杂交、Southern杂交对质粒转移结果进行确认,利用降解实验测试转移质粒降解基因的表达。【结果】质粒pDF01和pDF02在红球菌p52中均具有较高的稳定性,在LB培养基上连续传代少于47次时pDF02可保持,连续传代少于65次时pDF01可保持。质粒pDF01和pDF02具备在同属和属间接合转移的能力,可向受体菌——紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、大地两面神菌(Terrabacter tumescens)和节杆菌(Arthrobacter sp.)转移,其中以节杆菌作受体菌时质粒pDF01和pDF02接合转移频率最高,达到3.5×10~(-6)(接合子/受体菌);对节杆菌接合子质粒进行Southern杂交进一步确认了质粒pDF01、pDF02的存在。另外获得质粒pDF01、pDF02后的节杆菌接合子可以对二苯并呋喃高效利用,且降解能力与红球菌供体菌株p52相当。【结论】红球菌菌株p52可通过降解质粒转移强化生物修复过程,在去除环境中二噁英污染中具有良好的应用前景。     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

Streptomyces lincolnensis新遗传操作方法的建立以及lmbQ基因功能研究

以载体pSET152和pKC1139为出发质粒,通过供体菌大肠杆菌ET12567和S17-1转入林可链霉菌 (Streptomyces lincolnensis),建立和优化了接合转移体系.林可霉素生物合成基因簇中,lmbQ基因可能编码一个调控蛋白,构建了S.lincolnensis lmbQ基因中断载体,通过接合转移导入S.lincolnensis野生型菌株,筛选得到基因双交换突变株,通过PCR以及测序验证基因型正确,该突变株即为lmbQ同框敲除突变株.摇瓶发酵结果表明,lmbQ基因是一个正调控基因.     

细菌和放线菌质粒DNA的分离

到目前为止,所发现的细菌和放线菌的质粒DNA都是共价闭合超盘旋的环状结构。它的碱基组成与染色体DNA不同,分子量较染色体DNA小得多,有的质粒可以通过接合作用有效地转移到受体细胞中去。常利用质粒的这些特性来分离它们。现将几种分离质粒的方法介绍如下。     

大肠杆菌质粒RK8的分离及生化分析

耐药质粒RK8是从上海水域中的耐药大肠杆菌的RK8细胞中分出的,通过接合转移、转化、琼脂糖凝胶电泳及电镜测定,证明它是可转移的质粒,编码3″-羟基磷酸转移酶。由凝胶电泳可看出两种质粒区带,经电镜测定,根据周长计算,它们的分子量分别为:37.3×10~6,27.4×10~6道尔顿。将RK8与pBR322进行重组,其重组体带Km、Am、Tc三种抗性,分子量比RK8大。     

细菌抗药质粒中抗性基因的转座作用

ER275、ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)与DR233、DR416(Tc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)是来自临床的抗药质粒。当带有这些质粒的菌株分别与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对时,组成了两种质粒共存的菌株。用这种质粒共存的菌株作为接合转移的给体,并以Ap或Sm作为选择药物,得到ApKm或SmSuKm抗性类型的转移接合子,此种转移接合子能将ApKm或SmSuKm抗性作为一个单位连锁地转移到受体菌株,而且转移频率与R144drd3相似。 生化的研究表明,ER275、ER396质粒中的Ap抗性基因编码β-内酰胺酶,DR233与DR416质粒中的Sm抗性基因编码链霉素钝化酶,而带有Ap Km或Sm Su Km重组质粒的转移接合子也分别具有了合成这二种酶的能力。因此我们推测在ER275、ER396与DR233、DR416质粒中分别有可转座的Ap抗性基因与可转座的SmSu抗性基因存在。     

亚抑菌浓度头孢西丁对耐药质粒接合转移的影响

目的探讨亚抑菌浓度头孢西丁对耐药质粒接合转移的影响,研究病原菌耐药性播散的产生机制。方法采用聚合酶链反应（PCR）分析临床分离的63株产ESBLs肺炎克雷伯菌株SHV型β-内酰胺酶编码基因。质粒接合转移试验采用肉汤接合法。研究不同亚抑菌浓度头孢西丁（0、1、0.5、0.25、0.125μg/ml）和不同作用时间（2、4、6、8、10、12 h）下临床产ESBLs肺炎克雷伯菌株供体菌与受体菌E.coliC600接合转移频率的变化。结果63株临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌株有41株扩增出SHV型基因,阳性率为65.08%。随着亚抑菌浓度头孢西丁作用时间的增加,接合转移频率有随之增加的趋势。在相同作用时间下,头孢西丁浓度0.125μg/ml作用下的接合转移频率高于其他亚抑菌浓度的作用。结论应合理使用抗菌药物,减少抗菌药物的选择性压力,防止耐药细菌传播。     

抗生素和干扰素

931246定位于Laetoeoceu:lactis ATCC 11454染色体上的肚类抗生素乳酸链球菌肚前体的编码甚因〔俄〕/Rumer,L.M.…j Biotekhnologiya一1092,3一20~24〔译自DBA,1992,11(21),92一11798〕 通过接合作用将编码肤类抗生素乳酸链球菌肤的生物合成基因由Lae名oeoee翻s乙aet‘:ATCC11‘54转移到少质粒的 L.lac“s菌株(LMo23o、LPIT6)中。采用不同方法,从产乳酸链球菌肤的转接合体中分离出质粒的所有尝试均告失败。利用乳酸链球菌肚前体甚因的寡核普酸探针进行的印迹杂交实验表明,编码基因位于供体和转接合体的染色体上。(陶冶)931247卡那…     

质粒研究与载体构建

924281 嵌合质粒RSFIO10衍生物由大肠杆菌向枯草芽抱杆 菌的接合迁移[俄」/Doroshenko,V.G.…I B iotekhnologiya一1992,z一23一25〔译自DBA, 1992,11(11),92一06026〕 构建了穿梭载体质粒pERsF,它含有RSF 1010的复制子和迁移系统(来自质粒pAYC32)及 温敏复制子pE194(来自质粒pTVI)。质粒 pERSF可被枯草芽抱杆菌细胞稳定遗传,且在非选 择条件下经重复继代培养也不会遗失。通过接合只 能将pERSF由大肠杆菌C600转人大肠杆菌W335。 和枯草芽抱杆菌168。菌株168的所有氯霉素抗性转 接合体都是热敏型的。缺少将质粒由大肠杆菌转入…     

食源性沙门氏菌耐药性检测及相关质粒

[目的]测定390株沙门氏菌的抗生素药敏性,研究部分多重耐药株中质粒与其宿主耐药表型之间的关系及其在接合过程中对耐药性水平转移的影响.[方法]使用选择性培养基分离到沙门氏菌并通过PCR确认后,按照琼脂稀释法测定分离株对供试抗生素的药敏性,试剂盒提取代表性多重耐药株中的质粒,HindⅢ酶切,DPS软件分析电泳后质粒图谱.通过接合试验研究质粒在抗生素抗性水平转移中的作用.[结果]沙门氏菌分离株对四环素耐药最为普遍(58.2%),其次为链霉素(42.8%)、卡那霉素(39%)和氨苄青霉素(38.2%),对头孢西丁、氯霉素、庆大霉素、头孢曲松、阿莫西林甲氧苄啶、头孢替呋钠和萘啶酮酸的耐药率分别为27.2%、26.9%、21%、19%、18.2%、17.9%、14.6%和12.3%.抗性质粒编码的相同或相似沙门氏菌耐药表型与其中所含的耐药质粒并不呈现出严格的对应关系.质粒携带的抗性基因可通过接合作用转移,接合效率在2.4×10-4到5.6×10-1之间.[结论]食源性沙门氏菌对常用抗生素的多重耐药已经成为普遍现象,抗性质粒的同源性与其宿主耐药表型无直接相关性,其携带的耐药基因可通过接合作用在不同细菌种属之间高频传递.     

导入三叶草根瘤菌寄主范围基因对豌豆根瘤菌侵染白三叶草的影响

将带有三叶草根瘤菌寄主范围基因的豌豆根瘤菌(转移接合子182和290)接种白三叶草,观察比较它们对白三叶草早期侵染特征和结瘤情况。转移接合子182虽然诱导白三叶草根毛细胞弯曲,但未观察到侵染,也无侵染线形成;而转移接合子290能诱导白三叶草根毛形成紧密的弯曲,溶解根毛细胞壁和侵染白三叶草。结瘤试验表明,白三叶草接种转移接合子290所诱导的结瘤情况与接种三叶草根瘤菌野生型菌株ANU 843的情况很相似。转移接合子182只能诱导个别无效瘤,290和ANU843一样都能在白三叶草上结瘤。由此说明转移接合子如果只携带三叶草根瘤菌的部分寄主范围基因(FEL)仍不能在白三叶草上诱导侵染和正常结瘤,而必需携带全部寄主范围基因(FELMN)才能在白三叶草上正常结瘤。     

RNA的多维调控和应用

<正>RNA是生命起源的最初分子形式.原始的RNA分子既可自我复制又可催化化学反应.随着漫长的进化过程, RNA的催化功能逐步转移到蛋白质,而作为遗传信息承载者的功能则转移到DNA,并逐步形成了现代生物学的中心法则,即遗传信息先由DNA转录成RNA,再由RNA翻译成蛋白质.细胞中除了编码蛋白质的信使RNA(mRNA)外,还存在着大量种类不一、功能各异且不翻译成蛋白质的非编码RNA.     

委内瑞拉链霉菌秦岭变种属间接合转移系统的构建及透明颤菌血红蛋白的表达

【目的】构建委内瑞拉链霉菌秦岭变种属间接合转移系统及透明颤菌血红蛋白的表达。【方法】以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSET152和复制型pHZ1358为出发质粒,通过供体大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567(pUZ8002)进行属间接合转移委内瑞拉链霉菌秦岭变种。【结果】确定了该变种的最佳接合转移条件;通过SOE-PCR(Splicing by overlap extension PCR)技术构建含PermE和vhb结构基因融合片段的整合型表达载体pJD100,转化ET12567(pUZ8002)后属间接合转移委内瑞拉链霉菌秦岭变种。通过PCR和CO结合差光谱验证了vhb基因在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中的整合表达。【结论】本文首次探索了委内瑞拉链霉菌秦岭变种接合转移系统,确定了委内瑞拉链霉菌秦岭变种的最佳接合转移条件,并采用基因工程手段使vhb基因在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中获得表达。     

斑贝链霉菌接合转移系统的构建及透明颤菌血红蛋白基因的表达对其次级代谢的影响

以pSET152和pHZ1358为出发质粒,通过供体大肠杆菌ET12567(pUZ8002)和S17-1接合转移斑贝链霉菌(Streptomycesbambergiensis),构建和优化了接合转移体系。采用OOE-PCR技术构建含ermEp*与vhb结构基因融合片段的整合型表达载体pBIB2005,转化ET12567(pUZ8002)后,属间接合转移至斑贝链霉菌。通过PCR、CO结合差光谱验证vhb基因在斑贝链霉菌中整合表达。摇瓶发酵显示VHb蛋白能改善菌体对氧的需求,一定程度上促进细胞生长,提高抗生素产量。