RP4质粒及其带动的硫杆菌重组质粒psDt125在氧化硫硫杆菌中的接合转移

本实验选择了一种大肠杆菌(E.coli)和氧化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)均能生长的接合培养基。以大肠杆菌E.coli C600(RP4)为供体,以氧化硫硫杆菌T.t-3为受体,通过接合,直接将RP4质粒转移到氧化硫硫杆菌中,其Km~r,Tc~r基因得到表达,但Ap~r基因不表达。再将RP4质粒反向接合转移到E.coliHB101上,其三个抗性基因均表达。并且利用RP4质粒的带动将硫杆菌重组质粒psDt125直接转入氧化硫硫杆菌,其Cm~r基因表达。从而为氧化硫硫杆菌的基因工程改造提供了一条简便可行的遗传信息转移途径。     

棒杆菌启动子片段的酶谱分析及定位

用大肠杆菌启动子探测质粒pSDS I (Ap^r,Tc^s)从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)6282染色体的HindⅢ酶切片段中,克隆到两个具有启动功能的DNA片段,分别将两个重组质粒命名为pSDB5和pSDB21。含有这两个质粒的菌株均可以在含300μg/ml Tc的平板上生长。通过酶切分析,pSDB5的插入片段为1.6kb,pSDB21的插入片段为3.4kb,并分别作出了它们的限制性酶切图谱。对pSDB21利用其EcoR Ⅰ和BglⅡ位点,通过亚克隆删除了与启动功能无关片段,构建成pSDB210和pSDB211,从而使启动子定位于约0.1kb的BglⅡ/HindⅢ外源片段上。分子杂交实验证明所得到的这两个具有启动功能的DNA片段确实来源于钝齿棒杆菌6282的染色体DNA。