SM22α对血管平滑肌细胞骨架及收缩功能的影响

SM22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的标志蛋白,为了探讨该蛋白与VSMC表型和功能的关系,利用血清饥饿法诱导VSMC由合成型向收缩型转变,用RT—PCR对不同表型VSMC的SM22α表达活性进行检测,并通过转染反义SM22α表达载体,观察SM22α表达对VSMC细胞骨架和收缩功能的影响。结果显示,在VSMC由合成型逆转为收缩型的过程中,SM22α和平滑肌α-肌动蛋白(smooth muscle α—actin,SMα—actin)的表达分别被显诱导和轻度上调,与此同时,细胞骨架由稀疏的网格状变成均匀、致密的束状,VSMC重新获得收缩功能。用反义SM22α抑制该基因表达后,血清饥饿诱导的VSMC细胞骨架重构受阻,乙酰胆碱刺激引发的细胞收缩消失。结果提示,SM22α参与VSMC细胞骨架的构成及调节细胞的收缩功能,对维持VSMC处于收缩表型具有重要作用。     

SM22α对血管平滑肌细胞肌动蛋白聚合和交联的调节

目的:探讨平滑肌22alpha(SM22α)调节血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构的分子机制。方法:血清饥饿法诱导VSMC由合成型转化成收缩型,转染pEGFP-SM22α表达质粒后观察SM22α在细胞中的分布及其与肌动蛋白纤丝(F-actin)的定位关系;应用反义技术封闭内源性SM22α表达,蛋白分步提取和Western blot分析检测敲减SM22α基因表达对肌动蛋白单体G-actin聚合的影响;F-actin体外交联实验观察SM22α对F-actin交联成束的影响。结果:SM22α在细胞中的分布与F-actin相一致;抑制内源性SM22α表达后,细胞中的SMα-actin主要以可溶性单体G-actin形式存在;F-actin体外交联实验结果表明,GST-SM22α蛋白纯品可促进F-actin交联形成粗大、束状的应力纤维,而敲减内源性SM22α的细胞裂解液促进F-actin交联的活性明显降低。结论:SM22α是参与VSMC细胞骨架重构的调节蛋白,不仅可促进G-actin聚合形成F-actin,而且还可加速F-actin交联成束,在VSMC骨架重构过程中起着十分重要的作用。     

高血压相关基因hrg-1在血管平滑肌细胞再分化过程中的表达及功能

研究高血压相关基因hrg 1表达与血管平滑肌细胞 (VSMC)再分化的关系及其在细胞生物学行为调节方面的作用 .采用血清饥饿培养和全反式维甲酸诱导使处于增殖状态的去分化型VSMC再分化 ,观察细胞再分化过程中HRG 1表达变化 ,并探讨其功能 .在血清饥饿和维甲酸诱导VSMC再分化过程中 ,hrg 1基因表达显著上调 ,其表达活性在诱导 2 4h达高峰之后 ,一直维持在较高水平上 ,且其表达量和变化规律与细胞收缩蛋白SMα肌动蛋白和SM2 2α相类似 .免疫共沉淀和免疫双荧光染色结果证实 ,HRG 1抗体可与SMα肌动蛋白共沉淀 ,且两者在同一细胞共定位 .用HRG 1表达质粒转染去分化型VSMC可显著抑制其迁移能力 .结果提示 ,HRG 1在胞质中以与SMα肌动蛋白相互缔合的方式存在 ,其表达与VSMC分化有关 ,该蛋白通过参与细胞骨架构成而调节VSMC收缩与迁移     

细胞代数和密度影响血管平滑肌细胞表型重塑和收缩反应性的机制

探讨细胞代数和密度对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型重塑能力的影响及机制,观察血清饥饿诱导的不同代数和密度的VSMC骨架的组构特征及收缩反应性,检测细胞骨架中收缩蛋白的含量和比例变化。结果发现,低代数(3代)、高密度的VSMC经血清饥饿诱导后易于形成束状、极性排列的应力纤维,乙酰胆碱(Ach)刺激可产生明显的收缩反应。Western印迹显示,3代高密度VSMC中,平滑肌22α(SM22α)在F-肌动蛋白中的组成比例及其在F-/G-肌动蛋白的含量之比明显高于8代细胞。结果提示,SM22α在F-肌动蛋白中的分布比例可能决定了应力纤维的排布方式,是细胞获得收缩性的主要调节因素,在VSMC表型重塑过程中具有重要意义。     

PDGF-BB下调血管平滑肌标志物SM22α表达的机制

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）表型转化是血管重塑性疾病的细胞病理学基础,血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）-BB抑制平滑肌分化标志基因表达、加速其降解,是VSMC表型转化的关键。该研究用PDGF-BB刺激VSMC诱导细胞发生表型转化,利用Western blot和免疫共沉淀等技术,检测PDGF-BB对早期分化相关基因平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha,SM22α）磷酸化与泛素化的影响。实验结果显示,PDGF-BB促进VSMC增殖;上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调分化相关蛋白SM22α与SMα-actin的表达;诱导SM22α发生磷酸化和泛素化,而且,该过程与SM22α水平下调具有时相相关性;抑制剂阻断分析证实,ERK和PKC参与介导了PDGF-BB诱导的SM22α磷酸化。以上结果提示,在VSMCs表型转化中,PDGF-BB可能是通过激活ERK-PKC信号通路,促进SM22α的磷酸化和泛素依赖的蛋白质降解。     

SM22α在细胞骨架组构及血管重塑中的作用

血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的组构是当前研究的热点问题之一。平滑肌22α（SM22α）是近年发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性,该蛋白作为一种肌动蛋白细胞骨架相关蛋白参与VSMC骨架组构和收缩调节。本文就SM22α的结构特征及其在VSMC骨架组构和血管重塑中的作用机制进行综述。     

血清饥饿可诱导人血管平滑肌细胞再分化

体外培养的分化型血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells ,VSMC)以特异性标志基因表达、长梭形外观及对兴奋剂刺激产生收缩反应为其表型特征 .以血清饥饿法培养处于超汇合 (overconfluence)状态的人VSMC ,观察其分化型标志基因表达活性及其与细胞形态特征和收缩反应性之间的关系 ,探讨细胞生存环境对VSMC基因表达及表型的影响 .研究显示 ,生长至超汇合的VSMC由含血清培养转为血清饥饿后 ,收缩蛋白如SMα肌动蛋白 (SMα actin)、SM2 2α、h1 calponin、肌球蛋白重链 (MHC)SM1和SM2亚型的表达活性明显上调 ,证实血清饥饿诱导的收缩蛋白基因表达和血清应答因子 (serumresponsefactor ,SRF)与CArG顺式元件结合活性的增强有关 .同时 ,血清饥饿还可激活参与VSMC分化调节的转录调控因子SmLIM、Gax和分化相关蛋白HRG 1基因的转录 .随着血清饥饿培养时间的延长 ,VSMC逐渐形成多层、束状、成极性排列的形式 ,对兴奋剂刺激产生的收缩反应明显增强 .结果表明 ,超汇合状态的去分化型VSMC脱离血清刺激后 ,可以再分化成熟并重新获得收缩能力     

SM22α在血管平滑肌细胞中的作用

平滑肌22α(SM22α)是平滑肌细胞(VSMC)骨架相关蛋白,通过与肌动蛋白的作用参与VSMC骨架重构,是近年发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性.血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化是动脉粥样硬化、高血压等血管重塑性疾病的共同病理生理过程.VSMC表型转化过程中平滑肌特异基因的表达变化和细胞骨架的重构是当前研究的热点问题之一.本文就SM22α的结构特征及其在VSMC中的作用机制进行综述.     

SM22α:血管平滑肌细胞分化的分子标志

SM22α是一种分化型血管平滑肌细胞(VSMC)的标志基因,编码一种22kDa的收缩调节蛋白。由于SM22α基因结构短小,表达具有VSMC特异性、调控机制较为清楚,因而被广泛用于VSMC发育分化的研究。利用该基因的表达调控特征,设计可在VSMC中高表达目的蛋白的人工启动子,是心血管病基因治疗的新策略。     

MEF2A基因突变对血管平滑肌细胞增殖迁移及其表型的影响

目的:观察肌细胞增强因子2A(MEF2A)基因突变对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖迁移及其表型的影响。方法:分别将野生型(WT)MEF2A质粒(WT组)、21个核苷酸缺失突变型(△21,显性负突变)MEF2A质粒(△21组)以及MEF2A siRNA(siRNA组)转染进人主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),通过溴化噻唑基蓝四唑(MTT)法和Millicell小室观察各组VSMC的增殖和迁移变化,免疫印迹(Western blotting)检测各组VSMC之间MEF2A蛋白、平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)、SM22α、骨桥蛋白和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路表达差异。结果:MEF2A△21组和MEF2A siRNA组的VSMC增殖增加,迁移数量增多;同时此两组中α-SM-actin和SM22α表达减少,骨桥蛋白表达增加;磷酸化p38和ERK1/2表达也明显增强。结论:MEF2A基因显性负突变及沉默可使VSMC向合成型转化,其增殖和迁移能力增加。而p38和ERK1/2MAPK信号通路可能参与MEF2A基因介导的血管平滑肌细胞表型转化。     

重组SM22αC端肽段促进细胞骨架重构

目的:探讨SM22αC端功能域肽段与细胞骨架F-actin聚合的关系,明确SM22α在血管平滑肌细胞(VSMC)骨架重构中的作用。方法:构建GST-SM22αC端功能域融合蛋白原核表达质粒pGEX3X-SM22α,诱导E coli高效表达可溶性GST-SM22α融合蛋白,制备抗SM22α抗体,VSMC蛋白分步提取及Western blot检测F-actin/G-actin中SM22α的含量变化,GST-pull down分析和免疫共沉淀检测SM22α与actin的相互作用,细胞免疫双荧光染色观察SM22α和actin在VSMC中的定位关系。结果:所构建的pGEX3X-SM22α原核表达质粒,在0.5mmol/LIPTG,30℃诱导6h条件下,表达可溶性GST-SM22α融合蛋白的水平最高,用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得的抗血清效价为1∶16。免疫双荧光染色和蛋白分步提取分析结果表明,在VSMC再分析过程中,SM22α与F-actin共定位,GSTpull down分析和免疫共沉淀结果均显示,SM22α通过C端功能域与F-actin相互作用而参与细胞骨架的重构;但是,SM22α与G-actin的结合能力较弱。结论:本研究重组得到的SM22αC端功能域具有与F-actin结合的活性,SM22α通过该区域与actin相互作用而参与细胞骨架重构。     

血管损伤的新靶点：平滑肌22 alpha

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化是血管损伤性疾病动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等的共同病理生理过程.平滑肌22 alpha (smooth muscle 22 alpha, SM22α) 是一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性. 该蛋白不仅作为一种肌动蛋白细胞骨架相关蛋白参与VSMC骨架组构和收缩调节,它还参与VSMC的增殖、炎症和氧化应激等进程. 本文就SM22α 的结构特征及其在VSMC血管损伤中的作用机制进行综述.     

胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点.实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的胚胎小体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP.此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据.     

子宫平滑肌细胞SM22-α基因的pEGFP-C3载体构建及siRNA筛选

为研究SM22-α基因在子宫平滑肌中作用机制提供实验基础,通过筛查siRNA有效序列,来构建含SM22-α基因的pEGFP-C3-SM22-α载体.首先构建含有SM22-α基因的pEGFP-C3载体;其次利用FT293细胞并采用Western-bolt检测SM22-α蛋白表达的改变,筛查到siRNA有效序列;得到含SM22-α基因pEGFP-C3-SM22-α载体和干扰SM22-α表达蛋白的siRNA有效片段,成功干扰SM22-α蛋白在子宫平滑肌中的表达.     

Apelin-13促进血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管新生内膜增生

研究apelin-13对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）增殖和迁移的影响及其作用机制.用免疫印迹分析检测apelin-13对VSMC增殖、迁移以及分化相关基因表达的影响,结果表明,apelin-13能以时间和浓度依赖的方式诱导VSMC增殖和迁移相关基因cyclin D1和MMP-2表达,促进细胞增殖和迁移;同时使VSMC分化标志基因SM22α和SM α-actin表达水平降低.而且,用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色的结果显示,apelin-13可以促进VSMC从收缩表型向增殖表型转化.体内实验也表明,敲低apelin可抑制球囊损伤诱导的新生内膜形成,提示apelin-13在体内具有促进血管新生内膜形成的作用.总之,本文结果表明,apelin 13通过调节VSMC增殖、迁移以及分化基因表达,进而促进其从分化型向增殖型转化,并向内膜下迁移和增殖.     

平滑肌22α蛋白在血管稳态和血管重构中的作用

有关血管稳态和重构的分子机制一直是近年来的研究热点,也被视为治疗血管损伤性疾病的突破点。大量研究证实,血管损伤修复及病理性重构过程与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的表型转化、异常增殖与迁移、细胞衰老关系密切。平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)蛋白是一种在收缩型VSMCs中大量表达的细胞骨架相关蛋白,可通过与F-actin相互作用促进应力纤维形成,维持VSMCs收缩性,还可作为信号调节分子参与血管稳态和重构。本文综述了近年SM22α在血管稳态和血管重构中作用的研究进展。     

人SM22α在巴斯德毕赤酵母中的表达、纯化及抗体制备

目的：用酵母表达重组人平滑肌22α（SM22α）蛋白,制备兔抗人SM22α多克隆抗体。方法：利用PCR从pGEM3z—SM22α质粒扩增得到人SM22α基因编码区,重组至pPIC9构建酵母表达载体,转染巴斯德毕赤酵母,进行分泌型表达。表达产物经分步盐析和CM-纤维素柱层析纯化后,免疫家兔,制备兔抗人sM22α多克隆抗体。结果：所构建的pPIC9-SM22α酵母表达载体转染酵母感受态细胞后,外源性SM22α可整合至酵母染色体中,经甲醇诱导84h,可实现SM22α的高效表达与分泌。用70％硫酸铵处理上清液,收集沉淀进行离子交换层析纯化后,经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可见一分子量为22kD的单一区带。用该纯化产物免疫家兔制备的兔抗人SM22α抗血清可用于检测人或大鼠血管壁中SM22α的表达水平。结论：重组人SM22α可在巴斯德毕赤酵母中进行高效表达与分泌,纯化蛋白可用于抗体制备,为研究SM22α功能提供了检测工具。     

胚胎干细胞来源的拟胚体分化早期血管平滑肌标志物的表达时相

目的:研究胚胎血管发育早期SMα-actin、SM22α、myocardin、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)的表达规律,并初步探讨在此阶段血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法:采用转染平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体的胚胎干细胞制备拟胚体(EBs),用免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot分析SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC的表达时相;然后分别用0μmol/L(对照组)、10μmol/L、50μmol/L AG1296(血小板源性生长因子受体抑制剂)处理EBs,观察三组SMα-actin、SM22α、myocardin、SMMHC在基因及蛋白水平上的表达变化。结果:胚胎血管发育早期SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC分别在EBs第0(胚胎干细胞)、8、11、13d开始有表达。AG1296三种浓度处理后SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC蛋白表达及myocardin、SM22α和SMMHC mRNA表达均无明显差异。结论:EBs发育过程中存在着自发的VSMCs分化,SMα-actin表达最早,依次为myocardin、SM22α、SMMHC;PDGF-BB对EBs分化早期VSMCs标志物表达的调控可能不是必要的。     

RhoA和血清反应因子(SRF)介导E1A激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化

为探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)对人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体pLNCX2( )/CREG及pLXSN(-)/CREG制备稳定感染HITASY细胞模型,观察CREG蛋白过表达及表达抑制对人VSMCs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:pLNCX2( )/CREG稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子——血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,以Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,CREG诱导的SMα-actin表达下调的同时SRF出核转位;pLXSN(-)/CREG稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中CREG和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,CREG蛋白能被分泌到VSMCs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ型受体(M6P/IGF2R)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶PP2A特异性抑制剂okadaicacid减少M6P/IGF2R在细胞膜表面分布,可明显抑制CREG过表达引起的RhoA、SRF和SMα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人VSMCs中,CREG可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体M6P/IGF2R相互作用,依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMCs向分化表型转换.     

FAK和ILK介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移

黏着斑激酶（FAK）和整合素偶联激酶（ILK）是整合素信号途径中的重要信号转导分子,为阐明两者在血管平滑肌细胞（VSMC）黏附和迁移中的作用,以骨桥蛋白（OPN）作为VSMC黏附和迁移的诱导剂,检测其对FAK和ILK磷酸化以及对两者之间结合的影响.在此基础上,用FAK磷酸化特异性抑制剂黏着斑相关非激酶（FRNK）或ILK反义RNA分别阻断FAK磷酸化或ILK表达,进一步探讨两者在VSMC黏附和迁移中所起的作用.结果显示,OPN诱导可促进FAK磷酸化,诱导10 min后FAK磷酸化水平升高到对照组的2.4倍;与此同时,ILK的磷酸化受到抑制,30 min降至对照细胞的44.6％.OPN诱导FAK磷酸化的同时使FAK与ILK的结合减少.外源性FRNK在VSMC中的过表达显著降低FAK的磷酸化水平,促进ILK磷酸化和FAK与ILK之间的结合,抑制VSMC的黏附和迁移.用ILK反义RNA抑制ILK表达使VSMC在OPN上的黏附增加1.8倍,迁移细胞数降低45.5％.结果提示,FAK和ILK介导OPN诱导的VSMC黏附和迁移过程,两者通过对同一刺激信号产生不同的磷酸化变化而对VSMC的黏附和迁移产生不同的影响.