cDNA3‘端代表差异显示分析

根据真核ｍＲＮＡ３’端一般含Ｐｏｌｙ（Ａ）的原理,可使用共同引物将不同的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,然后设计特殊引物进行反转录ＰＣＲ,或者将限性酶切与呱转录ＰＣＲ偶联使用,均可获得对应于ｍＲＮＡ３’端的ｃＤＮＡ３’端代表扩增子。     

cDNA3′端代表差异显示分析

根据真核ｍＲＮＡ３′端一般含Ｐｏｌｙ（Ａ）的原理,可使用共同引物将不同的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,然后设计特殊引物进行反转录ＰＣＲ,或者将限制性酶切与反转录ＰＣＲ偶联使用,均可获得对应于ｍＲＮＡ３′端的ｃＤＮＡ３′端代表扩增子。比较不同条件下的ｃＤ－ＮＡ３′端代表扩增子,可以获得两种或多种细胞中ｍＲＮＡ的表达差异谱,并分离、克隆差异表达的基因序列     

cDNA3′端代表差异显示分析

根据真核ｍＲＮＡ３′端一般含Ｐｏｌｙ（Ａ）的原理,可使用共同引物将不同的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,然后设计特殊引物进行反转录ＰＣＲ,或者将限制性酶切与反转录ＰＣＲ偶联使用,均可获得对应于ｍＲＮＡ３′端的ｃＤＮＡ３′端代表扩增子。比较不同条件下的ｃＤ－ＮＡ３′端代表扩增子,可以获得两种或多种细胞中ｍＲＮＡ的表达差异谱,并分离、克隆差异表达的基因序列 。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆,序列测定及其在COS—7细胞中的表达

本文利用反转录ＰＣＲ技术从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出ｈＴＰＯ　Ｎ－端和Ｃ－端两个ｃＤＮＡ片段,然后经酶切分别连接重组到质粒ｐＵＣ１９中进行序列分析,在确证其序列与国外文献报道完全一致的基础上,酶切、回收、连接其Ｎ－端、Ｃ端ｃＤＮＡ,并以此为模板,用ＰＣＲ法扩增出全长ＴＰＯｃＤＮＡ片段,并将其重组到穿梭质粒ｐＳＶＫ３中,在ＣＯＳ－７中进行了瞬时表达并检测出表达产物的活性     

簇毛麦低拷贝cDNA序列的克隆和鉴定

从簇毛麦叶片中提取总ＲＮＡ,进一步分离ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ,两端经Ｔ４ＤＮＡ多聚酶修平后加ＥｃｏＲ１接头分子,连接于质粒ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）的ＥｃｏＲ１克隆位点,转化大肠杆菌ＪＭ１０３菌株建立了ｃＤＮＡ文库。用ＰＣＲ扩增重组质粒的ｃＤＮＡ插入序列,用＾３２Ｐ标记后分别与ＨｉｎｄⅢ或ＸｂａⅠ酶切的小麦－黑麦附加系ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交。根据其杂交结果,目前已鉴定出４     

重叠片段法克隆全长人肝细胞生长因子cDNA

通过重叠片段的ＲＴ－ＰＣＲ方法,从人胎盘组织克隆了人全长肝细胞生长因子ｃＤＮＡ片段（约２２００ｂｐ）,经酶切证实和测序分析都表明该片段确为人ＨＧＦｃＤＮＡ。本文所用方法解决了扩增较长目的基因片段时,由于ＲＮＡ酶及反转录酶的ＲＮＡ酶Ｈ活性和ｍＲＮＡ二级结构等多种因素的影响,使获取长片段ｃＤＮＡ难以成功的难点     

利用Tag DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究

应用ＴａｑＤＮＡ聚合酶直接对ＲＮＡ进行反转录成ｃＤＮＡ第一链,然后用特异引物进行ＰＣＲ扩增,结果表明,反转录达到ＡＭＶ逆转录酶的效果,且可能得到比ＡＭＶ逆转录酶更完整的ｃＤＮＡ第一链。     

菠菜磷酸丙糖转移蛋白在烟草中正义及反义表达及其对碳水化合物转运的影响

以菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）为材料,取幼叶分离ｍＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ第一链为模板,通过ＰＣＲ扩增,获得菠菜磷酸丙糖转移蛋白（Ｔｒｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ,ＴＰＴ）ｃＤＨＡ目的片段。对其进行序列分析,结果表明,分离的目的片段核苷酸序列与文献报道相比同源率为９９．９％,只不１个碱基发生改变。将得到的菠菜ｔｐｔ ｃＤＮＡ与ＣａＭＶ３５     

中国人r——干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－ｒ－ｃＤＮＡ,序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－ｒｃＤＮＡ序列存在多态性的推论。在此基础上应用ＤＮＡ重组技术,将去信号肽中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子下游,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ,其表达水平占全菌可溶性总     

海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

以担子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ第一链,以ｃＤＮＡ第一链为模板经ＰＣＲ扩增海藻糖合酶（Ｔｓａｓｅ）基因,获得一长约２．２ｋｂ的片段,把该片段连接一ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ上进行测序,其全长共２１９９ｂｐ。随后将此片段以正向插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的ＨｉｎｄⅢ＋Ｘｂａｌ位点构建ｐＵＢ,再把海藻糖合酶基因以正向插入载体ｐＵＢ的ＢａｍＨ     

一种鉴别差异表达基因的新方法：———cDNA示差分析技术

ｃＤＮＡ示差分析技术是继ｍＲＮＡ差异显示技术之后又一种鉴别差异表达基因的方法。该技术利用双链ＤＮＡ模板在ＰＣＲ时呈指数扩增,而单链ＤＮＡ模板为线性扩增原原理,先用常见的限制性内切酶将实验组与对照组消化成平均长度为２５６ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,再用ＰＣＲ技术使用组的ｃＤＮＡ片段富集,随后进行３次差减杂交去除共有基因,最后扩增实验组中的特异表达的基因。本概述了该技术的原理、基本方法及其应用前景。     

黄瓜花叶病毒山东株（CMV—SD）RNA2全和cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶ－ＳＤＲＮＡ２的５’和３’未端序列,在此基础上,利用ＲＴ－ＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡＤＱ ＢＴＧ Ｐｃ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２Ｆ。     

中国人雄激素受体N端转示激活区的测序及突变检测

雄激素受体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＡＲ）Ｎ端转录激活功能区（ＡＦ１）是ＡＲ发挥转录激活所必需的。用４对引物（Ａ３－Ａ４）ＰＣＲ扩增２０例中国正常男性ＡＲ的ＡＦ１,双链ＤＮＡ循环测序以确定正常中国人ＡＲ的ＡＦ１的核苷酸顺序。在此基础上,用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析和双链ＤＮＡ循环测序法对２例雄激素抵抗征（ＡＩＳ）患者外周血白细胞和１５例前列腺癌（ＰＣ）患者癌组织中ＡＲ的ＡＦ１区进行突变检测。     

应用循环逆转录PCR技术检测丙型肝炎病毒RNA

循环逆转录（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ,ＣＲＴ）是线性增长逆转录ｃＤＮＡ产量的一种新技术。为了将该技术用于检测ＨＣＶ ＲＮＡ,通过改变ＣＲＴ的循环次数,结合竞争ＰＣＲ,作出标准曲线。采用１６次ＣＲＴ加３４次循环ＰＣＲ检测了１３６例ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ阳性、５４例ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ阴性和１０８例临床可疑病人全血标本,并与逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）和巢式ＰＣＲ（     

草鱼出血病病毒基因组的cDNA合成、克隆及部分序列分析

采用差速离心的方法纯化感染草鱼出血病病毒的细胞悬液。提纯的病毒粒子经蛋白酶Ｋ处理和酚氯仿抽提,在１％琼脂糖凝胶电泳条件下分离得到１１条ｄｓＲＮＡ,利用柱离心式胶回收试剂盒纯化各基因片段。纯化的ｄｓＲＮＡ溶于９０％的ＤＭＳＯ中,７０℃变性１５ｍｉｎ,然后采用随机引物法反转录合成各基因片段的ｃＤＮＡ,并平头连接于ｐＺＥｒＯ２．０载体的ＥｃｏＲＶ位点,电转化ＴＯＰ１０感受态细胞。重组质粒经酶切、ＰＣＲ扩增得到大小不等的插入片段,ｃＤＮＡＲＮＡ斑点杂交的结果进一步证实其插入为目的基因片段。采用循环ＰＣＲ测序的方法,对其插入片段进行了序列测定,对其中第１１片段的部分序列作了报道。     

发展中的mRNA差别显示技术

随着ＰＣＲ技术的出现（１９８５）,在分子生物学界又相继出现了两个很有影响的新技术──ＲＡＰＤ技术（１９９０）和ｍＲＮＡ差示法（１９９２）,前者用于分子标记,后者用于基因分离。ｍＲＮＡ差示法的生物学基础是基因的差别表达,既：单个细胞中表达的基因仅占基因总数的１５％。这种基因的差别表达决定了生命的所有过程,如：发育和分化、对逆境的反应、细胞分裂、老化等,图一给出了该方法最初的技术路线。提取要比较的两种或两种以上样品的ｍＲＮＡｓ,分别逆转录成ｃＤＮＡｓ,经过ＰＣＲ扩增后,直接进行测序胶电泳即可识别有差别的ｍＲＮＡ。其中、关键的是ＰＣＲ扩增时两个引物的设计．３＇端引物Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ＭＮ很容易与具有Ｎ＇Ｍ＇－ｐｏｌｙ（Ａ）－３＇末端的大多数ｍＲＮＡ结合,进行ｃＤＮＡ的逆转录合成。Ｍ、Ｎ提供锚定位点,防止３＇端引物在ｐｏｌｙ（Ａ）序列不同位置上的随机结合。５＇端为１０个碱基的随机引物。这个经验上的碱基数值较理论的６－７个碱基（表一）更能满足测序胶电泳要求的条件：分子大小在５００ｂｐ左右,每条泳道上条带数在１００条左右。该方法近年来又有如下改进：一、ＰＣＲ退火温度由４２℃改为４０℃,可在保证特异性的同时,增加泳道上的     

植物甜蛋白mabinlinⅡcDNA的克隆与序列分析

根据已由作者克隆的ｍａｂｉｎｌｉｎⅡＢ亚基１８５ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,设计合成系列引物．从马槟榔（ＣａｐｐａｒｉｓｍａｓａｉｋａｉＬéｖｌ．）种子提取总ＲＮＡ并纯化ｍＲＮＡ,经反转录合成ｃＤＮＡ第一链．采用ＲＡＣＥ方法,快捷克隆ｍａｂｉｎｌｉｎⅡ全长ｃＤＮＡ．经序列测定与分析,该ｃＤＮＡ为５８３ｂｐ,其中编码序列长４６５ｂｐ,共编码１５５个氨基酸．     

应用逆转录聚合酶链反应法扩增类胰岛素生长因子Ⅱ基因

利用酸性异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法从人胚胎组织中提取总ＲＮＡ,经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维柱分离纯化出ｍＲＮＡ。用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出人类胰岛素生长因子Ⅱ的ｃＤＮＡ片段,在限制性内切酶ＳｍａＩ存在的连接体系中,将扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆进ＰＵＣ１２的ＳｍａＩ位点处。经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,ＳａｌＩ,Ｅｃｏ４７Ⅲ酶切鉴定其方向。以重组质粒的双链ＤＮＡ为模板,用末端终止法测     

人血小板生成素受体c—MPL膜内部分的聚合作用

血小板生成素（ＴＰＯ）是调节血小板生成最主要的细胞因子,其生物学效应由其受体ｃ－ＭＰＬ介导。利用酵母双杂合系统研究ｃ－ＭＰＬ膜内部分在ＴＰＯ信号转导途径中的功能。首先用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法从人红白血病ＨＥＬ细胞系总ＲＮＡ中扩增并克隆Ｐ型ｃ－ＭＰＬ（ＭＰＬＰ）膜内部分ｃＤＮＡ,经测序验证后克隆至双杂合载体ｐＡＳ２和ｐＧＡＤ４２４中,重组质粒命名为ｐＡＳＭＭ和ｐＧＡＤＭＭ。将ｐＡＳＭＭ与ｐ     

随机扩增多态DNA影响因素的研究

随机拉多态ＤＮＡ分析受诸多因素的影响,我们发现不同厂家制造的ＰＣＲ扩增仪,不同厂家出品的ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ缓冲液,ＲＡＰＤ反应体系中的引物浓度,Ｍｇ＾２＋浓度,ｄＮＴＰ浓度,ＢＳＡ和明胶,以及模板ＤＮＡ的量等均可能对ＲＡＰＤ结果有不同程度的影响。