H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别

建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究.参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp.经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应.敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带.结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型.另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力.     

H7亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;阳性棉拭子最低检出量为103EID50/mL。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测,仅有H7亚型AIV有特异性目的条带,与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较,表明在10-1的样品浓度下,两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。     

H6亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立一种快速、敏感、特异的检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列的保守区8个位点设计了6条特异性LAMP引物,以H6亚型AIV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,对反应条件和反应体系进行优化.结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应.该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01 pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法.     

多重RT-PCR快速检测禽流感病毒的研究

西北农林科技大学生物工程研究所陈思怀、湖北省农科院牧医研究所乔宪凤、华文君等6位科学工作者参考H1-H15亚型禽流感病毒(AIV)的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因,共设计4对引物,建立了2对引物扩增AIV的NP、HA基因的多重RT-PCR方法。应用此法分别对H5、H6、H9亚型AIV尿囊液RT-PCR,电泳,回收预期片段进行测序,并同Genebank的注册序列进行同源性分析。     

实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究

选取H5、H9、H7亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）血凝素( hemagglutinin, HA) 基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计了各自亚型的特异性引物和Taqman MGB探针,利用实时荧光RT-PCR一步法建立了H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的鉴别检测方法,该方法特异性好,重复性佳,对其他疫苗无交叉反应。结果表明实时荧光PCR方法为禽流感灭活疫苗提供了一种特异、敏感、快速和简洁的鉴别检测方法。     

实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究

选取H5、H9、H7亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,利用PrimerExpress2.0软件设计了各自亚型的特异性引物和Taqman MGB探针,利用实时荧光RT-PCR一步法建立了H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的鉴别检测方法,该方法特异性好,重复性佳,对其他疫苗无交叉反应。结果表明实时荧光PCR方法为禽流感灭活疫苗提供了一种特异、敏感、快速和简洁的鉴别检测方法。     

高致病性A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组序列测定方法的建立

建立以Sanger测序方法为基础的新型A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组扩增方法。从GenBank和Global Initiative on Sharing All Influenza Data(GISAID)下载近五年H5亚型流感病毒的HA基因序列,N6亚型流感病毒的NA基因序列,以及H5N1和H9N2亚型流感病毒内部6个基因序列,每个基因序列分别进行比对,在相对保守区域设计用于分段扩增的引物,共32对,选用3株病例分离病毒及6株环境分离病毒对引物进行验证。优化后的32对引物能够有效地扩增9株H5N6亚型禽流感病毒,其中3株病例分离病毒的扩增产物条带单一,无非特异扩增。6株环境标本分离病毒扩增产物中,个别反应有非特异扩增产物。建立了一种能够获得高致病性H5N6亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,该方法简单、快速,为新型H5N6亚型禽流感病毒的进化分析提供了基础。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

高致病性A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组序列测定方法的建立北大核心CSCD

建立以Sanger测序方法为基础的新型A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组扩增方法。从GenBank和Global Initiative on Sharing All Influenza Data(GISAID)下载近五年H5亚型流感病毒的HA基因序列,N6亚型流感病毒的NA基因序列,以及H5N1和H9N2亚型流感病毒内部6个基因序列,每个基因序列分别进行比对,在相对保守区域设计用于分段扩增的引物,共32对,选用3株病例分离病毒及6株环境分离病毒对引物进行验证。优化后的32对引物能够有效地扩增9株H5N6亚型禽流感病毒,其中3株病例分离病毒的扩增产物条带单一,无非特异扩增。6株环境标本分离病毒扩增产物中,个别反应有非特异扩增产物。建立了一种能够获得高致病性H5N6亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,该方法简单、快速,为新型H5N6亚型禽流感病毒的进化分析提供了基础。     

H5亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的H5亚型禽流感病毒的血凝素（HA）基因,通过分析流感数据库221个HA序列,在保守区内用Oligo6.0软件设计并合成了一对引物,建立了用于快速诊断H5亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR方法,其扩增的目的片段大小为372bp。通过对H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行不同稀释倍数检测,结果表明病毒尿囊液最低检出量为10-4稀释;阳性棉拭子最低检出量为8倍稀释。用病毒分离和该方法同时检测不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,结果表明该方法检测灵敏度比病毒分离低10～100倍。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,仅有H5亚型禽流感病毒扩增出特异性目的条带。该方法具有方便快捷、特异性强、敏感性高等特点,为我国禽流感的快速诊断和分子流行病学调查提供了技术支撑。     

改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用

根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物 ,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约 16 83bp的血凝素基因 ,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体 ,限制性酶切及序列测定后 ,进一步将其亚克隆到pGEX-KG中 ,与GST蛋白融合表达。SDS-PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA基因在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有免疫学活性 ,融合蛋白的分子量约为 90kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点 ,可用于H9亚型禽流感抗体的检测。     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

H9N2亚型禽流感病毒基因组的遗传进化分析

2009～2011年从江苏省、湖北省和安徽省等地来源于鸡、鸭、鹌鹑和鸽子的样品中分离鉴定出16株H9N2亚型禽流感病毒。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出分离株的全基因片段,并对其进行测序及遗传进化分析。序列分析显示,16株病毒HA基因裂解位点氨基酸序列为P-S-R/K-S-S-R,符合低致病性禽流感的分子特征;226位均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特性。M2基因均出现了对金刚烷胺产生耐药性的N31S突变。不同宿主来源的H9亚型AIV的主要分子特征一致。全基因遗传进化分析表明16株H9N2亚型禽流感病毒全基因发生了3配体重组,即以F98亚系AIV为骨架,HA来源于Y280亚系,PB2和M基因来源于G1亚系,形成了2种新的基因型。因此,要加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注它的重组趋势。     

在疫苗免疫选择压力下H9N2亚型禽流行性感冒病毒HA基因的遗传变异

为了解H9N2亚型禽流行性感冒(流感)病毒在同亚型灭活疫苗的选择压力下的遗传变异情况,对某鸡场的感染鸡群进行连续4年的跟踪监测,对使用疫苗前和持续使用疫苗后不同时段分离到的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行全序列分析.结果表明,在使用第一次分离的病毒株制备的疫苗后8个月分离到的病毒株,其HA基因仅发生一个氨基酸的差异;但在继续使用该疫苗的第二个和第三个年头分离的病毒株,它们的HA基因则一直在发生较大的变化.这一发现对进一步研究禽流感病毒在不断使用疫苗的选择压力下发生变异的规律,指导制定正确的禽流感防制对策具有重要意义.     

一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

分离到一株鹅源 H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感．病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险．血凝素(hemagglutinin, HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒．核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004 (H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/　2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA 与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%．进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来．