胰岛素及其类似物缔合行为及酪氨酸微环境的比较研究

用三种紫外差光谱技术对Ins、DPI、DOI分子缔合行为及酪氨酸微环境进行了比较研究。结果显示DPI、DOI与Ins一样,存在着随pH与浓度的缔合。表明与β-折迭结构相比,疏水相互作用在分子缔合中起主要作用。但从Ins的缔合能力较DPI、DOI强,可认为β-折迭对维持二体的稳定仍有重要作用。溶剂微扰结果显示,在1 mg/ml所研究的三个pH(1.8,3.5,7.5),Ins存在的最小单位是二体,而DPI、DOI在pH 1.8,7.5主要以单体形式存在,但在pH 3.5则呈现强烈缔合并导致一个酪氨酸由暴露到埋藏的变化。DPI有一个位于缝隙中的酪氨酸残基,它仅能为重水微扰,而不能被DMSO微扰,推测它是A_(19)酪氨酸。微扰研究还表明Ins与DPI和DOI在缔合及pH、浓度差光谱产生的机理上有所不同。在所研究的条件下,Ins缔合是从二体到六体的过程,这一过程仅导致二体间A_(14)酪氨酸氢键形成,并不涉及酪氨酸暴露与埋藏的变化。而DPI和DOI则是从单体到二体(或更高聚体)的过程,这一过程涉及酪氨酸由暴露到埋藏的变化。pH滴定的结果未发现Ins、DPI、DOI酪氨酸滴定行为的不同。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅳ.溶液中的缔合性质、酪氨酸微区及主链构象

研究去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的空间结构对了解胰岛素分子的结合部位是重要的,本文研究了它的部分空间结构性质。1.用凝胶过滤法研究了DPI的性质,说明接近生理环境的条件下(pH7.0,离子强度0.3),DPI没有自缔合性质,而是以单体存在。因此推论胰岛素的作用单位是单体,它以单体与受体结合并传递信息。2.用紫外差吸收法测定了DPI的pH差光谱,变性差光谱与热变性曲线。这些结果说明DPI的三个酪氨酸侧链暴露在分子表面。3.测定了DPI的圆二色性(CD)曲线。pH7.0时,远紫外CD曲线与胰岛素相似,但[θ]220毫微米负值变小。这可能说明DPI的主链与胰岛素基本相同而略有松散。近紫外CD曲线与胰岛素很不相同,谷顶在266毫微米,[θ]负值变小。讨论了Phe与-S-S-提供贡献的可能。结合本系列工作的Ⅲ、Ⅳ两文,可以认为,DPI的空间结构研究的结果支持胰岛素分子二体内单体间的疏水面是结合部位的一部分这一假设。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅲ.高分辨核磁共振研究

研究了胰岛素(Ins)和去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的250兆周核磁共振,发现DPI、Ins核磁共振谱之间存在着差异。这说明胰岛素分子羧端五肽的切除引起在溶液中局部构象变化。这种构象变化似乎不影响Ins分子的生物活性。许多研究表明Ins分子在溶液中存在着解离聚合平衡,聚合状态与溶液浓度、pH有密切关系。如果改变DPI和Ins溶液的浓度及pH,前者波谱变化不明显,后者随溶液浓度、pH增加而增加。Ins波谱中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3部分与芳香环质子部分共振峰均加宽。这些说明DPI在无Zn~( )溶液中不存在解离聚合平衡,而可能以单体形式存在。     

人小肠三叶因子的理化性质及光谱学行为

酵母表达的重组人小肠三叶因子(rh-ITF)飞行质谱测定二聚体的分子量为13154,等电点约为4.5～4.75.紫外和荧光光谱表明rh-ITF在pH2.7～8.4和pH2.7～7.7时,吸收值增加。随pH进一步增加,吸收值降低。推测色氨酸和酪氨酸所处微环境发生了一定的变化。园二色谱表明在不同pH下,rh-ITF所含二级结构百分数有所变化,但仍保留有一定的二级结构,即含有一定数量的α-helix,β-sheet或β-turn,其三级结构基本不变。光电滴定和有机溶剂微扰法表明rh-ITF分子中有两个酪氨酸,一个处于分子表面,另一个参与氢键的形成或存在于一个非极性的环境中。rh-ITF中的色氨酸处于分子内部。另外,质谱测定rh-ITF在体外对酸和蛋白酶有一定的抗性     

B链羧端去八肽胰岛素的核磁共振研究

用~1H核磁共振(简称NMR)卷积差谱和温度差谱技术对胰岛素与去八肽胰岛素(简称DOI)局部溶液构象进行了比较研究。通过二者NMR谱的比较发现胰岛素和DOI谱的CH_3峰区存在明显差异。DOI三维结构的屏蔽效应明显降低;以缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3组成的峰区变尖、变窄、接近自由蜷曲状态蛋白质谱。高场区0.42ppm的峰肩为A_2-异亮氨酸在三维结构中受邻近A_(19)-酪氨酸屏蔽影响的高场位移峰,该峰在DOI谱中消失。因此暗示着A链头尾密切联系着的三维结构遭到破坏。用温度差谱简化NMR谱。比较了胰岛素与DOI二者随温度上升构象变化的过程以及各自对热的不稳定性,表明DOI分子在溶液中还保存一定的特定构象;但结构相当松散,热不稳定性增加。胰岛素经去B链羧端八肽后局部构象将有明显变化,可能导致胰岛素某种特定空间结构受到破坏。这也可能是DOI分子生物活性丧失的一个重要原因。     

胰岛素与类似物结构与功能关系的核磁共振研究

对胰岛素及其类似物DPI(去五肽胰岛素),DOI(去八肽胰岛素)的~1H NMR(核磁共振)变温谱进行了比较研究。胰岛素的三维结构随温度上升发生明显的变化,以Val、Leu、Ile的CH_3组成的高场峰区(0.2～1.1ppm)的峰形逐渐变尖变窄,特别突出的是0.34～0.42ppm峰肩当温度升高至50℃以上逐渐向低场移动以至消失。此峰肩为A_2-Ile的两个CH_3受邻近A_(19)-Tyr芳香环的环流场屏蔽影响的高场位移峰。DPI变温谱具有与胰岛素十分相似的变化。而对比DOI的变温谱,我们发现常温时,由于A链头尾紧密联系的极性区构象已遭破坏,因而不出现此峰肩。此局部构象可能与DPI保存有相当大的生物活性和DOI丧失生物活性有关。胰岛素的A链头尾三维构象随温度上升至50℃以上的明显变化与胰岛素和受体结合活性在温度高于50℃被破坏的结果是一致的。这就提示了结合活性的变化与某些三维构象的变化可能是相关的。这也支持了A链头尾形成的极性区很象是胰岛素“结合部位”的一部分。     

B 链羧端去八肽胰岛素的核磁共振研究

用~1H 核磁共振(简称NMR)卷积差谱和温度差谱技术对胰岛素与去八肽胰岛素(简称DOI)局部溶液构象进行了比较研究。通过二者NMR 谱的比较发现胰岛素和DOI 谱的CH_3峰区存在明显差异。DOI 三维结构的屏蔽效应明显降低;以缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3组成的峰区变尖、变窄、接近自由蜷曲状态蛋白质谱。高场区0.42ppm 的峰肩为A_2-异亮氨酸在三维结构中受邻近A_(19)-酪氨酸屏蔽影响的高场位移峰,该峰在DOI 谱中消失。因此暗示着A 链头尾密切联系着的三维结构遭到破坏。用温度差谱简化NMR 谱。比较了胰岛素与DOI 二者随温度上升构象变化的过程以及各自对热的不稳定性,表明DOI 分子在溶液中还保存一定的特定构象;但结构相当松散,热不稳定性增加。胰岛素经去B 链羧端八肽后局部构象将有明显变化,可能导致胰岛素某种特定空间结构受到破坏。这也可能是DOI 分子生物活性丧失的一个重要原因。     

Asn-Ala-Gly-Ala及Asn-Ala-Gly-Ala-Asn在溶液中的构象—远紫外圆二色性

用远紫外圆二色性研究了四肽Asn-Ala-Gly-Ala和Asn-D-Ala-Gly-Ala-NH_2及五肽Asn-Ala-Oly-Ala-Asn 的构象。在低pH 的水溶液中,五肽给出一正一负的峰,正的在215nm,负的在232.5nm。[θ]_215随pH 的关系类似滴定曲线。推想此时呈β-转角。在近中性或碱性水溶液中,圆二色谱只有195nm 的负峰,因此呈无规卷曲。pH5.8时加乙醇或三氟乙醇至90%,五肽给出218 nm 附近的负峰。设想此时分子呈类β-折迭。NAGA 给出215 nm 附近的正峰,但没有负峰。讨论了此分子呈现β-转角的可能性。NDAGA 只有在196nm 附近的负峰,因此推测它具无规卷曲。潘小平等报道,上述肽都有镇痛作用,看来这种作用与分子的立体结构无关。     

Asn-Ala-Gly-Ala及Asn-Ala-Gly-Ala-Asn在溶液中的构象—远紫外圆二色性

用远紫外圆二色性研究了四肽Ash-Ala-Gly-Ala和Asn-D-Ala-Gly-Ala-NH_2及五肽Asn-Ala-Gly-Ala-Asn的构象。在低pH的水溶液中,五肽给出一正一负的峰,正的在215nm,负的在232.5nm。[θ]_(215)随pH的关系类似滴定曲线。推想此时呈β-转角。在近中性或碱性水溶液中,圆二色谱只有195nm的负峰,因此呈无规卷曲。pH5.8时加乙醇或三氟乙醇至90%,五肽给出218nm附近的负峰。设想此时分子呈类β-折迭。NAGA给出215nm附近的正峰,但没有负峰。讨论了此分子呈现β-转角的可能性。NDAGA只有在196nm附近的负峰,因此推测它具无规卷曲。潘小平等报道,上述肽都有镇痛作用,看来这种作用与分子的立体结构无关。     

α－苦瓜子蛋白和β－苦瓜子蛋白紫外光谱的研究

对α－ｍｍｃ及β－ｍｍｃ进行了溶剂微扰差光谱的研究及在不同温度条件下的光谱滴定,结合最新得到的α－ｍｍｃ的晶体结构进行了分析和讨论,并与天花粉蛋白的紫外光谱进行了比较。     

α－苦瓜子蛋白和β－苦瓜子蛋白紫外光谱的研究

对α－ｍｍｃ及β－ｍｍｃ进行了溶剂微扰差光谱的研究及在不同温度条件下的光谱滴定,结合最新得到的α－ｍｍｃ的晶体结构进行了分析和讨论,并与天花粉蛋白的紫外光谱进行了比较。     

转甲状腺素蛋白抑制β淀粉样蛋白聚集的分子机制研究

目的 转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）具有神经保护作用,这种保护作用表现在TTR能抑制β淀粉样蛋白（amyloid beta protein,Aβ）的病理性聚集。本工作将从分子层面上探究TTR与Aβ的作用机制,揭示TTR对AD的神经保护作用。方法 蛋白质-蛋白质对接用于探究不同结构形式的TTR与Aβ的作用模式,并运用分子动力学模拟方法来探究二者相互作用的动态过程。结果 TTR四聚体及单体均能与Aβ单体作用,TTR四聚体的甲状腺素结合通道是Aβ单体的主要结合部位。此外,TTR四聚体的EF螺旋、EF loop同样能够结合Aβ单体。当TTR四聚体解离后,TTR单体的内部片层疏水部位暴露,该部位对Aβ单体具有较强的亲和力。TTR与Aβ聚集体作用,由于TTR单体与Aβ聚集体均为富含β折叠的结构,使得二者能够共聚集形成聚合度更高的聚集体,从而降低Aβ聚集体的细胞毒性。结论 TTR四聚体和单体通过“扣押”Aβ单体来抑制Aβ的聚集,TTR单体与Aβ聚集体形成高聚合度复合物来降低Aβ聚集体的细胞毒性。本工作为基于TTR...     

平阳霉素三种成份诱发染色体畸变的研究

本文报道了抗癌新药平阳霉素(PYM)三种成份(A_2、A_5、A_6)诱发蚕豆根尖细胞染色体畸变的效应。结果表明PYM的主要成份A_5的诱变能力显著高于A_2和A_6,从而找出了平阳霉素诱变能力大于博莱霉素的原因。同时观察到平阳霉素可诱发出大量特异的散碎型染色体畸变。上述三种成份诱发的畸变绝大多数属于染色体畸变,很少有染色单体畸变。另外并出现大量的微核,证明PYM很可能是一种不依赖S期效应的诱变剂。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B 链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B 链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30(?),与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B 链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30,与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

兔小肠刷状缘膜蔗糖酶—异麦芽糖酶复合体的圆二色光谱研究

在磷酸钾缓冲液中,pH6.8,25℃时,S-I酶复合体的近紫外CD谱显示280～281nm的负峰,293～294nm的正峰。在288,269,和263nm处有3个肩膀。溶液pH值变化和对此酶的热失活处理都能使280～281nm负峰缩小,可能表示酪氨酸残基微环境和酶活力有关。S-I酶复合体的远紫外CD谱显示较大的215nm负峰和较小的192nm正峰,表示其骨架构象以β-折迭和无规卷曲为主。此远紫外CD谱在pH2.3～11范围里维持不变,也不受55℃热失活处理的影响。Na~+和tris对此酶CD谱不产生影响。高浓度盐酸胍能改变其近紫外和远紫外CD谱形。     

东亚马氏钳蝎(Buthus martensi karsch)蝎毒神经毒素的园二色性研究

本文研究了从东亚马氏钳蝎中纯化的神经毒素BmKⅢ的园二色性,并对不同类型毒素的CD光谱进行了比较.BmKⅢ在水溶液中的近紫外CD谱在274和290nm处显示二正峰,279nm处显示一肩峰.远紫外CD谱在209nm处呈一强负峰,为典型的β-折迭图谱.在中性水溶液中,其主链构象参数分别为4.0%α-螺旋,63%B-折迭,33%无规卷曲和回折.溶液的pH对BmKⅢ的构象影响不大,但分子在碱性溶液中构象的变化较之中性及酸性溶液稍大.温度的升高对其分子的构象有影响,但这种温度诱导的构象变化是可逆的.SDS的加入可诱导β-折迭转变为α-螺旋.在同时存在β-疏基乙醇时,分子的有序结构完全消失.几种不同的哺乳动物神经毒素以及它们同甲壳动物神经毒素的比较研究指出,它们的远紫外CD谱很相似, 但其近紫外CD谱却有差异,尤其是哺乳动物类同甲壳动物类毒素之间差异更大.     

中华眼镜蛇细胞毒素溶液构象的激光拉曼光谱研究

由中华眼镜蛇细胞毒素CTⅡ、CTⅢ和CTⅣ水和重水溶液的拉曼光谱,按照Lippert的方法计算了它们的二级结构含量.β折叠含量为33-35%,无规卷曲为59%.后者包括大量β回折结构.根据S-S伸缩振动频率,C-C-S-S-C-C构型都属于扭曲—扭曲—扭曲式.它们的三个酪氨酸残基有两个埋藏在分子内部,一个暴露在分子表面.联系已知结构的神经毒素erabutoxin b对上述结果进行了论讨.     

盾叶薯蓣地上部分的三个新甾体皂甙

从盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensis Wright地上部分分离鉴定了四个甾体皂甙,经鉴定甙A为约莫皂甙元-3-O-[α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖甙;甙B为24α-羟基约莫皂甙元-3-O-[α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)]β-D-葡萄吡喃糖甙;甙C为约莫皂甙元-3-O-[α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)][β-D-葡萄吡喃糖基(1→4)]-β-D-葡萄吡喃糖基;甙D为约莫皂甙元-3-O-[α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)][β-D-葡萄吡喃糖基(1→3)]-β-D-葡萄吡喃糖甙。前三者为新化合物,分别命名为盾叶皂甙A_1、A_2、A_3(zingiberoside A_1、A_2、A_3),其中盾叶皂甙A_2的甙元为一新甾体皂甙元,命名为盾叶皂甙元(zingiberogenin)。     

大肠杆菌表达的重组猪β2微球蛋白二级结构的圆二色谱分析

摘要：【目的】研究巴马小型猪β2微球蛋白（β2m）的结构和功能。【方法】亚克隆巴马小型猪β2m的成熟肽部分,并构建与pMAL-p2X的重组质粒,转化大肠杆菌TB1并诱导后,融合表达蛋白分别经过 Western-blot、纯化及Factor Xa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(circular dichroism spectrum, CD)测定蛋白的二级结构。【结果】重组表达的融合蛋白MBP-β2m大小为52.1 kDa。切割后去除MBP的单体蛋白大小为10.6 kDa。圆二色谱分析单体蛋白β2m二级结构