胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30,与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素作用原理的研究——Ⅰ.胰岛素及其类似物与其受体的相互作用

研究了一些胰岛素B链羧端肽段改变了的类似物与肝细胞及脂肪细胞的受体蛋白结合性质。这些结果说明,去B链羧端五肽胰岛素与胰岛素有相同的结合能力;去B链羧端六肽胰岛素及B_(23)被D-丙氨酸取代的去B链羧端六肽胰岛素有明显的结合;去B链羧端八肽胰岛素具极微的结合能力;胰岛素A链、促肾上腺皮质素、增血糖素不与胰岛素受体蛋白结合。在此基础上还讨论了B_(24)芳香环参与胰岛素结合部位的可能性,并假设B_(12),B_(16),B_(24),B_(25)疏水平面可能是结合部位的重要内容。而B_(20)～B_(23)U形转折及A_(21)…B_(22)盐键的作用是稳定疏水平面结构。胰岛素与受体的结合类似于胰岛素二体中两个单体的结合。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅲ.高分辨核磁共振研究

研究了胰岛素(Ins)和去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的250兆周核磁共振,发现DPI、Ins核磁共振谱之间存在着差异。这说明胰岛素分子羧端五肽的切除引起在溶液中局部构象变化。这种构象变化似乎不影响Ins分子的生物活性。许多研究表明Ins分子在溶液中存在着解离聚合平衡,聚合状态与溶液浓度、pH有密切关系。如果改变DPI和Ins溶液的浓度及pH,前者波谱变化不明显,后者随溶液浓度、pH增加而增加。Ins波谱中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3部分与芳香环质子部分共振峰均加宽。这些说明DPI在无Zn~( )溶液中不存在解离聚合平衡,而可能以单体形式存在。     

用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D—Ala—PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,Lys或Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~B_(22)-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~B_(22)不是胰岛素活力所必需。但Arg~B_(22)若为D-Arg或Gly代替,活力很低。     

用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯OMe—(DNIOH)。OMe—DNIOH的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D-Ala-PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,BOG—Lys或OTB—Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~(B_(22))-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~(B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~(B_(22))不是胰岛素活力所必需。但Arg~(B_(22))若为D-Arg或Giy代替,活力很低。     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅳ.B_(22)-精氨酸的改变对胰岛素生物活性的影响

本文叙述了一系列B_(22)-精氨酸改变的B_(23)-D-Ala去B链羧端六肽胰岛素类似物的半合成。半合成途径是胰岛素六甲酯(INS-OMe)经胰蛋白酶和羧肽酶B作用得到去B链羧端九肽胰岛素五甲酯OMe-(DNIOH),A_1和B_1的α-氨基用Boc-基保护后与X-D-Ala·PheOMe(X=Gly,D-Arg,Val,Arg,Boc-Lys和OTB-Asp)缩合,三氟乙酸和皂化去除所有的保护基。这些类似物的生物活力表明;B_(22)-Arg并非不能改变,它用Lys甚至Asp代替后,不影响活力,活力水平约为天然胰岛素的20%。当B_(22)-Arg用Val代替后活力降低一半,而用Gly或D-Arg代替后,活力很低。文中对B_(22)-Arg在维持胰岛素构象和对胰岛素生物活力的影响以及豚鼠胰岛素活力低的原因等问题进行了讨论。     

反相高效液相层析在胰岛素结构与功能研究中的应用

采用一种简单的“甲醇-水-0.1％三氟醋酸”作为洗脱体系的反相高效液相层析对研究胰岛素结构与功能关系,以及A链和B链相互作用时所用的一些胰岛素衍生物进行了快速、灵敏、准确的分析和鉴定。 胰岛素的S-磺酸型A链和B链只经一次离子交换层析纯化,经鉴定结果表明是均一的。S-硫甲基型A链和B链基本上也是均一的。通过对胰岛素还原产物的分析确定了能保证胰岛素折分完全并对其重组较为有利的还原条件。去B链羧端五肽(B26—30)胰岛素,以及去B链羧端八肽(B23—30)胰岛素能同时与天然胰岛素清楚地分离。一级结构差别极小的猪胰岛素和牛胰岛素也可得到分辨。胰岛素的羧端缩短的B链和A链重组的定量分析表明B链羧端肽段不但对胰岛素分子的生物活力的体现,而且在A链和B链的正确重组中都起着重要的作用。     

去B链羧端七肽(B24～30)胰岛素的制备——羧肽酶-A限制性水解去五肽胰岛素

用羧肽酶-A对去B链羧端五肽胰岛素进行限制性酶解,得到去B链羧端七肽胰岛素,反应条件是pH7.4,0℃,10小时。水解产物经Sephadex G-50柱分离,并经羧端顺序与氨基酸组成分析鉴定。用小白鼠惊厥法测定,这一去七肽胰岛素制剂有4.7%的胰岛素活力。     

去B链羧端七肽胰岛素的免疫活性及受体结合能力

测定了胰岛素类似物去B链羧端七肽胰岛素(DHPI)的免疫活性和它与受体的结合能力。DHPI能与豚鼠抗胰岛素血清反应,生成免疫沉淀条纹。经放射免疫测定,它的免疫活力是胰岛素的1.8%。DHPI在低剂量时不能和胰岛素受体(大白鼠脂肪细胞和豚鼠红细胞)结合,高剂量时有明显结合。DHPI与豚鼠红细胞胰岛素受体的结合不显示负协同效应,而胰岛素与它的结合显示负协同效应。     

去B链羧端七肽胰岛素的免疫活性及受体结合能力

测定了胰岛素类似物去B 链羧端七肽胰岛素(DHPI)的免疫活性和它与受体的结合能力。DHPI 能与豚鼠抗胰岛素血清反应,生成免疫沉淀条纹。经放射免疫测定,它的免疫活力是胰岛素的1.8%。DHPI 在低剂量时不能和胰岛素受体(大白鼠脂肪细胞和豚鼠红细胞)结合,高剂量时有明显结合。DHPI 与豚鼠红细胞胰岛素受体的结合不显示负协同效应,而胰岛素与它的结合显示负协同效应。     

B链羧端去七肽(B24～B30)胰岛素:一种新晶型的结构

B链羧端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素 (DHPI)在同样的晶体生长条件下可以得到两种晶型 ,即晶型A和晶型B .测定了 0 .2nm分辨率B型DHPI(DHPI B)的晶体结构 .B型DHPI分子的整体结构与已报道的A型DHPI分子 (DHPI A)很相似 ,但局部区域的构象以及分子在晶胞中的堆积存在较大的差异 .DHPI的晶体结构显示了 ,在结晶条件下 ,一个独立区内 2个DHPI单体分子构成了一个DHPI二体 .DHPI A和DHPI B因二体形成而包埋的作用面 (作用面Ⅱ )面积分别达到 1 8.2 0和 1 6 .95nm2 ,这一面积在目前所有胰岛素及其类似物的晶体结构中是最大的 .仔细考察胰岛素及其截断体类似物的晶体结构可以发现 ,该作用面广泛存在于这些分子的缔合作用中 .研究结果表明 ,作用面Ⅱ在同一晶体生长条件下 2种晶型的形成中起关键作用 .     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究 Ⅴ.用萤光探针1,8-TNS对疏水区的初步研究

1,8-TNS与溶剂极性和粘度关系的研究,证明正如它们的位置异构物2,6-TNS一样具有萤光疏水探针的性能。我们用此探针比较研究了胰岛素、去B链羧端五肽胰岛素(DPI)、牛血浆白蛋白、溶菌酶、卵白蛋白的疏水表面性质。结果表明DPI和胰岛素相似,存在一个小而确定的疏水区。提示B链羧端五肽的去除并未严重改变其与受体结合有关的疏水面结构。在生理pH值其疏水面暴露较胰岛素略大。但其疏水面构象稳定性较胰岛素弱,随pH升高,分子局部构象可能发生扭动,疏水面构象遭到一定程度的破坏。总的来讲,DPI结构较胰岛素松散,稳定性亦下降。     

B27K—去B链C端三肽胰岛素的制备、生物活力与自聚合性质

液相合成五肽Gly Phe Phe Tyr Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B2 7K 去B链C端三肽胰岛素(B2 7K DTrI,B2 7K destripeptideinsulin)。用小鼠惊厥法和小鼠降血糖法测得B2 7K DTrI的整体生物活力为标准胰岛素的 80 % ,B2 7K DTrI与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的 ( 12 5± 13 ) %。用凝胶过滤法证明B2 7K DTrI自聚合性质降低 ,具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B2 7K DtrI结构中 ,B2 7T被K取代 ,其优点是在酵母中表达其前体后 ,可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得     

白鲢胰岛素的一级结构

白鲢是淡水鱼之一,其胰岛几乎不杂有外分泌腺,较易提取多肽激素,从中可分离出三方结晶胰岛素。本文报道了白鲢胰岛素的一级结构。与哺乳类及海水鱼胰岛素相比,它的结构特征如下:A链8、9、10位的氨基酸残基为组氨酸、赖氨酸、脯氨酸;A_(13)与A_(14)为异亮氨酸和苯丙氨酸,类似于一般鱼胰岛素,而差异于哺乳类胰岛素的相应位置。它的A_(15)为谷氨酸,A_(17)为谷氨酰胺,恰与哺乳类胰岛素的相应位置对调,其它鱼类胰岛素的A_(15)则为天冬氨酸,A_(17)也为谷氨酰胺。它的B链为三十一肽,N端区相当特殊,其N端延伸出额外的两个氨基酸残基。B_(13)与B_(21)都为天冬氨酸,而哺乳类胰岛素的相应位置均为谷氨酸。B链的羧端少一个氨基酸,这与一些鱼胰岛素的结构相似,而与其他种类的胰岛素有很大区别。本文就其结构与功能关系进行了讨论。     

白鲢胰岛素的一级结构

白鲢是淡水鱼之一,其胰岛几乎不杂有外分泌腺,较易提取多肽激素,从中可分离出三方结晶胰岛素。本文报道了白鲢胰岛素的一级结构。与哺乳类及海水鱼胰岛素相比,它的结构特征如下:A链8、9、10位的氨基酸残基为组氨酸、赖氨酸、脯氨酸;A_(13)与A_(14)为异亮氨酸和苯丙氨酸,类似于一般鱼胰岛素,而差异于哺乳类胰岛素的相应位置。它的A_(15)为谷氨酸,A_(17)为谷氨酰胺,恰与哺乳类胰岛素的相应位置对调,其它鱼类胰岛素的A_(15)则为天冬氨酸,A_(17)也为谷氨酰胺。它的B链为三十一肽,N端区相当特殊,其N端延伸出额外的两个氨基酸残基。B_(13)与B_(21)都为天冬氨酸,而哺乳类胰岛素的相应位置均为谷氨酸。B链的羧端少一个氨基酸,这与一些鱼胰岛素的结构相似,而与其他种类的胰岛素有很大区别。本文就其结构与功能关系进行了讨论。     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用——Ⅱ.电子显微镜观察

在前文中我们报导了S-磺酸型胰岛素B链(以下简称B链)在pH6—9间直线聚合作用的一些现象和影响聚合作用的一些因素。根据粘度与流动双折射的变化,我们推断聚合过程可分成诱导、聚合与胶凝三个阶段。在诱导阶段,B链单体形成核心,此后核心乃发展而形成纤维。其解聚过程也经探索,但尚未找到彻底解聚的条件。     

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达,获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原,表达产物占细胞总蛋白量的１３％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素,其氨基酸组成与预期值相符,受体活性是标准猪胰岛素的１％．