农杆菌介导的紫色红曲霉遗传转化体系的建立和优化

通过优化各种转化因素,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导红曲霉(Monascus)的高效转化体系:红曲霉在PDA培养基培养21 d后收集孢子,制备红曲霉孢子悬浮液,浓度为106个/mL,根癌农杆菌浓度为OD600值0.5,诱导剂AS浓度为100μmol/L,农杆菌与红曲霉在25℃共培养3 d。采用此转化体系构建了含有530多个转化子的红曲霉T-DNA插入突变体库。随机选取50株转化子菌株进行分子验证和稳定性检测,证明T-DNA成功插入红曲霉基因组DNA中,并能稳定遗传。最后,通过形态观察筛选出8株变异较大的菌株,为以后的红曲霉基因功能研究奠定了一定的基础。     

农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株

建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库,高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉,抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法,结合发酵液p H与聚苹果酸含量响应变化,微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株,基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株,每107个细胞可获得80-120个转化子,出芽短梗霉H27号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%,基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库,结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。     

根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系的建立

赭曲霉在工业上用于甾体C-11α羟基化。为了对现有赭曲霉生产菌株进行遗传改造,以农杆菌LBA4404作为侵染菌株,以赭曲霉(TCCC41060)作为受体菌株,以潮霉素B基因作为筛选标记,成功建立了根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系并对其转化效率的主要影响因素,如农杆菌浓度、孢子浓度、共培养时间和温度等进行了分析。在最佳条件下,转化效率可以达到57个转化子/108个分生孢子。随机挑选的8个阳性转化子10代连续培养结果表明所获得的转化子能稳定遗传。该遗传转化体系的建立为赭曲霉菌株的定向遗传改造提供了重要的操作平台。     

根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系的建立及优化

基于根癌农杆菌介导的遗传转化方法的独特优点,研究黑曲霉转化过程中各主要影响因素,建立高效的黑曲霉遗传转化方法。构建双元载体pBI-hph,通过电转导入农杆菌LBA4404中,以黑曲霉TCCC41056为受体菌株,利用潮霉素B基因作为筛选标记,对影响转化效率的孢子悬液的新鲜程度及浓度、农杆菌菌液浓度、共培养时间、共培养温度这五个条件进行分析,建立根癌农杆菌介导的黑曲霉遗传转化体系。实验结果表明,上述条件对黑曲霉的转化效率有较大的影响,通过优化,黑曲霉转化效率可达83个转化子/10⁷分生孢子;整合到黑曲霉基因组的外源基因可以稳定遗传,在转接10代后遗传性能仍保持稳定,并在众多转化子中筛选得到了糖化酶活力提高18%的黑曲霉突变株。根癌农杆菌介导的黑曲霉转化体系的建立,为进一步研究黑曲霉的功能基因以及开发黑曲霉表达系统提供了有力的手段。     

农杆菌介导的蛹虫草营养缺陷型菌株和遗传转化体系的构建

【背景】天然蛹虫草是蛹虫草菌侵染昆虫蛹或虫形成的子实体,具有非常重要的生物药理活性。目前蛹虫草基因组测序已经完成,但是其分子生物学研究较少。【目的】在蛹虫草中构建一种以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌介导的转基因体系。【方法】乳清酸核苷-5′-磷酸（orotidine-5′-monophosphate,OMP）脱羧酶为尿嘧啶合成必需酶,利用根癌农杆菌介导的转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）方法,通过同源重组对蛹虫草野生型菌株中该酶的编码基因pyrG进行敲除,构建尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体。然后,利用本实验室已有的米曲霉pyrG为筛选标记的二元转化载体,通过农杆菌转化法对该营养缺陷型菌株进行遗传转化。【结果】通过同源重组法,成功敲除pyrG构建了尿嘧啶营养缺陷型蛹虫草,以此为背景,在22℃共培养66h,成功对蛹虫草实现转基因,转化效率为（75±35）/10⁶孢子。另外,本研究还发现丝状真菌常用的构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA及α淀粉酶启动子PamyB不能在蛹虫草...     

根癌农杆菌介导里氏木霉转化体系的建立和条件优化

目的:采用根癌农杆菌介导的转化方法实现丝状真菌里氏木霉的遗传转化,并优化转化条件.方法:构建含潮霉素抗性基因(hph)的双元载体pCAM-hph后,转化根癌农杆菌LBA4404获得转化菌株.将根癌农杆菌的转化菌株和里氏木霉的分生孢子共培养后在含100μg/mL潮霉素的抗性平板上筛选里氏木霉转化子,并采用PCR扩增和序列测定对转化子中的插入片段进行了分析.结果:使用根癌农杆菌介导的转化方法转化里氏木霉,每106个分生孢子可获得25.8个转化子.最佳的转化条件为:农杆菌初始浓度为OD660约为0.8,孢子数为106个,共培养时间为48h,pH为5.0～5.5,培养温度为28℃.结论:建立了根癌农杆菌介导的里氏木霉转化方法,并获得了最佳的转化条件.     

链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证

本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(Ttrpc)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROK Ⅱ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A.alternata转化效率的影响对体系进行优化.结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200 mL(OD_(600)=0.15),A.alternata分生孢子浓度为10~6个/mL,在A.tumefaciens的预培养时期以及与A.alternata共培养时期分别加入200 μmol/LAS,共培养时间48 h,转化率达120～200个/10~5分生孢子.在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达.该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础.     

橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库构建及其致病缺陷转化子筛选

【目的】进一步研究橡胶树胶孢炭疽菌致病分子机理。【方法】通过含ILV1基因(具氯嘧磺隆抗性)的pSULF.gfp双元载体农杆菌AGL-1介导进行橡胶树胶孢炭疽菌遗传转化,利用氯嘧磺隆抗性标记筛选转化子,对转化子PCR验证及荧光显微观察;采用离体古铜期橡胶树叶无伤接种法进行致病性缺陷转化子筛选,并对转化子进行遗传稳定性检测。【结果】获得含3 721个转化子的T-DNA插入突变体库,转化效率为150 400个转化子/106孢子,从3 721个转化子中筛选得到致病性缺陷转化子25个;随机选取20个转化子进行遗传稳定性测定,在不含氯嘧磺隆PDA平板上继代培养10次后仍保持氯嘧磺隆抗性,且表型稳定,表明插入外源基因能够稳定遗传。【结论】可以利用根癌农杆菌介导橡胶孢炭疽菌转化,构建橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库,筛选致病缺陷突变菌,为进一步研究该菌致病相关基因提供材料。     

纤维素降解球毛壳菌NK-102的高效遗传转化方法

摘要:【目的】在球毛壳菌(Chaetomium globosum)NK-102 中,建立菌株特异性转化体系。【方法】构建新的抗性标记pUCATPH-Pgap,转化效率优于pUCATPH 和pCM768。建立了PEG-原生质体和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 介导的两种转化方法。【结果】原生质体转化效率为30－50 个转化子/10 μg DNA,抗性标记pUCATPH-Pgap 效率最高。EHA105 介导转化率达到3.2×102 转化子/107 孢子。Sout     

农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化

【目的】将农杆菌介导的转化应用于重要的工厂化栽培食用菌斑玉蕈中,建立稳定的农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化技术。【方法】将构建的双元载体pYN6982转入农杆菌LBA4404菌株中,以斑玉蕈SIEF3133菌株打碎的双核菌丝为受体材料,利用根癌农杆菌介导的转化方法进行斑玉蕈转化试验。【结果】经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定以及有丝分裂稳定性试验验证,表明潮霉素磷酸转移酶基因(hph)已经整合到斑玉蕈的基因组中;转基因斑玉蕈菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光,表明增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)已经在转基因斑玉蕈菌株中获得了表达;通过PCR检测,随机挑选的8个转基因斑玉蕈菌株中有2个可以扩增出载体转移DNA(T-DNA)边界重复序列外的卡那霉素基因(kan)序列。【结论】获得了稳定遗传和表达的斑玉蕈转基因菌株,建立了农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化方法。农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化中,存在载体T-DNA边界重复序列之外的DNA序列转移到转基因斑玉蕈中的现象,有待进一步研究。     

农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子及产孢缺陷突变子T-DNA插入位点分析

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA系统,建立转化黑曲霉(Aspergillus niger)分生孢子的方法,构建T-DNA插入突变子文库,为黑曲霉基因组功能注释研究打下基础。【方法】采用携带二元质粒载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105,诱导转化黑曲霉分生孢子,筛选具有潮霉素抗性的突变子。分析抗性稳定突变子菌株的表型,采用反向PCR方法分析T-DNA插入位点相邻位置的序列,并推测突变基因可能具有的功能。【结果】实验获得具有稳定潮霉素抗性转化子193株,转化率为5.6×102转化子/108分生孢子。部分转化子表型出现较为明显改变,其中一株不能产孢,对其T-DNA插入位点序列分析比对结果显示,突变基因属于超级转运家族(major facilitator superfamily,MFS)。【结论】本研究建立的农杆菌转化黑曲霉分生孢子平台,结合T-DNA插入突变位点分析,可以为黑曲霉基因组功能注释研究提供一种简便有效的途径。     

A bacterial artificial chromosome library of Lotus japonicus constructed in an Agrobacterium tumefaciens-transformable vector

We constructed a BAC library of the model legume Lotus japonicus with a 6-to 7-fold genome coverage. We used vector PCLD04541, which allows direct plant transformation by BACs. The average insert size is 94 kb. Clones were stable in Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens.     

黑曲霉菌株柠檬酸合成酶基因的敲除及功能分析

【背景】柠檬酸合成酶是碳代谢途径的中心酶,其在三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)、氨基酸合成和乙醛酸循环中发挥着重要作用,是柠檬酸合成的关键酶。本论文所选用的是一株高产柠檬酸的黑曲霉菌株CGMCC10142。【目的】克隆柠檬酸合成酶关键基因,构建柠檬酸合成酶的敲除菌株并鉴定其在黑曲霉菌株高产柠檬酸过程中的功能及影响。【方法】采用根癌农杆菌转化方法并利用同源重组原理,采用抗性筛选和致死型反向筛选的双重筛选方法获得正确敲除株。对转化子在不同碳源下的生长情况进行观察并对柠檬酸发酵过程中菌丝球变化和产酸量进行分析,最后通过荧光定量PCR分析柠檬酸合成酶基因对黑曲霉积累柠檬酸的影响,及其对主要代谢途径中重要酶相关基因和其他的表达量的影响。【结果】以柠檬酸高产菌株黑曲霉CGMCC10142为出发菌,构建一株遗传稳定的柠檬酸合成酶敲除的菌株T1-2。结果发现该菌株在以葡萄糖为碳源的培养基上生长缓慢并且产生孢子量减少。通过摇瓶发酵产酸实验,结果表明敲除菌在84 h产酸量为64.3 g/L,相对于出发菌的98.7g/L降低了34.85%。通过荧光定量PCR发现柠檬酸合成酶的表达量是下降的,同时重要酶的表达量都下降。【结论】该菌株的柠檬酸合成酶基因对柠檬酸积累具有重要作用,但存在其他同工酶基因,该基因敲除仅使产酸合成降低34.85%,同时发现该柠檬酸合成酶的顺畅表达有助于主代谢途径中各关键酶的高效表达,本研究可为研究黑曲霉高产柠檬酸机理奠定基础。     

农杆菌介导的红曲菌T-DNA插入突变库的构建及色素突变子的性质分析

以农杆菌EHA105为介导,将带有潮霉素抗性基因和gus基因的T-DNA片段转化到红色红曲菌(Monascusruber)中。通过转化条件的优化,成功构建了含有5132个转化子的T-DNA插入突变库。根据菌落颜色与色素分泌情况筛选到50株色素突变子,聚合酶链式反应(PCR)表明上述突变子均有T-DNA片段插入。经5代的继代培养后,94%的突变子具有稳定性(潮霉素抗性)。对突变子产色素和桔霉素能力的分析表明其分泌次生代谢产物的能力发生了较大变化。本方法的建立,为进一步深入研究红曲菌的代谢调节和基因功能奠定了基础。     

RNAi沉默lovF基因实现土曲霉一步法发酵生产辛伐他汀

辛伐他汀是重要的降胆固醇处方药物。莫那可林J是辛伐他汀合成过程的关键中间体,也是洛伐他汀生物合成的中间产物。为获得莫那可林J并通过一步法发酵生成辛伐他汀,构建了洛伐他汀生物合成关键基因lov F基因的RNAi载体p MHJ137,通过农杆菌介导的方法转化土曲霉F001,筛选整合到染色体的阳性菌,并在阳性菌株MJ1-24的发酵过程中加入了DMB-S-MMP验证其直接合成辛伐他汀的效率。结果显示MJ1-24不再产生洛伐他汀,产物中仅有莫那可林J累积。如果在发酵过程中加入前体物质,可得到产物辛伐他汀。综上,RNAi技术能够有效实现土曲霉基因沉默。此项技术推进了一步法发酵生产辛伐他汀的工艺开发。     

农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立

以兼具生态和能源植物功能的木本模式植物——杨树(河北杨)为材料,研究了携带促生长基因(35S-DAS5)的根癌农杆菌载体介导的河北杨遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示,较适宜的转化系统为预培养2-4 d,农杆菌菌液(OD600值为0.4)侵染20 min,共培养4 d,在含30 mg/L卡那霉素(Km)的培养基上诱导不定芽,生根培养基中Km的适宜浓度为10 mg/L。     

Spontaneous mutation conferring the ability to catabolize mannopine in Agrobacterium tumefaciens.

Two nopaline-type strains of Agrobacterium tumefaciens, C58 and T37, as well as strain A136, which is a Ti plasmid-cured derivative of strain C58, gave rise to spontaneous mutants that were able to grow on mannopine. The observation of mutagenesis with strain A136 demonstrated that the ability to acquire this new catabolic potential was independent of the presence of a Ti plasmid. The mutants were isolated after 4 weeks of incubation on minimal medium containing mannopine as the sole carbon source. They also utilized mannopinic acid, but not agropine or agropinic acid. In addition, the spontaneous mutant LM136, but not its parent strain A136, degraded many mannityl opine analogs. [14C]mannopine disappeared in the presence of LM136 cells which had been pregrown on opine or nonopine substrates. These results suggested that the catabolic system of this mutant was not subject to a stringent regulation. A clone conferring the ability to utilize mannopine on a recipient pseudomonad was selected from a genomic library from both the mutant LM136 and its parent strain. Only the LM136 clone was expressed in the parent Agrobacterium strain A136. Southern analysis showed that the genes for mannopine catabolism in the spontaneous mutants differed from the corresponding Ti plasmid-encoded genes of octopine-type or agropine-type Agrobacterium strains. Cells of LM136 utilized [14C]mannopine without generating detectable amounts of intracellular agropine. In contrast, a major fraction of the radioactivity recovered from cells of the octopine-type strain Ach5, after incubation on [14C]mannopine, was in the form of agropine.     

农杆菌GV3101中反式玉米素合成基因促进烟草再生

胭脂碱型农杆菌GV3101已经被广泛用于植物遗传转化研究。已有的研究结果证明,农杆菌GV3101株系含有的反式玉米素合成 (trans-zeatin synthesizing,tzs)基因编码产物会影响烟草细胞器的形态及细胞的生理状态。然而,有关tzs基因对遗传转化过程外植体再生的影响研究却少有报道。本文在前期研究工作的基础上,以2种烟草、4个农杆菌株系为组培实验材料,验证了胭脂碱型农杆菌tzs基因产物的生理活性。结果表明：以外源添加生长调节物质的外植体为阳性对照,在不添加任何生长调节剂的培养基上,与GV3101菌株共培养的烟草外植体能分化再生,并发育成完整植株;外植体再生与GV3101携带的质粒种类无关;外植体与农杆菌GV3101培养液共培养24 h,烟草再生效果较好;与GV3101株系共培养24 h,将外植体烟草叶片匀浆,经亲和柱分离纯化后,检测出烟草外植体叶片中高达0.78 ng/g FW-1的反式玉米素含量。菌落PCR扩增结果证实,农杆菌GV3101株系有tzs基因序列。以上结果表明,农杆菌GV3101株系内的tzs基因的表达产物有生理学活性,能够促进烟草外植体再生,调节细胞生长。     

新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。