负调节基因nsdA在链霉菌中同源性及激活沉默抗生素合成基因簇的研究

nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因。以nsdA基因片段为探针,通过Southern杂交发现nsdA存在于多种链霉菌中。根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物,扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链霉菌中nsdA基因的相似性高达77%～100%。其中变铅青链霉菌与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA序列100%一致。变铅青链霉菌通常不合成放线紫红素,中断nsdA获得的突变菌株WQ2能够合成放线紫红素;在WQ2中重新引入野生型nsdA,又失去产抗生素能力。表明nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达;nsdA的广泛存在及其序列高度保守则提示可以尝试用于这些菌种的抗生素高产育种。     

游动放线菌8-22中treY基因敲除对于降低阿卡波糖C组分的作用

【目的】在阿卡波糖发酵过程中,C组分的存在严重影响阿卡波糖产品的质量,研究拟通过基因改造降低阿卡波糖C组分。【方法】通过构建treY同框敲除质粒pUAmT-YUD,以接合转移方法将其转入阿卡波糖工业菌株8-22,经同源重组将treY基因内部编码182个氨基酸的序列敲除,从而得到treY基因失活的突变株Y810。【结果】发酵结果显示突变菌株中C组分较出发菌株下降了约10倍,而阿卡波糖本身的效价末受影响。【结论】敲除treY基因可大幅降低阿卡波糖C组分的含量。研究的实施将大大简化阿卡波糖的纯化步骤,提升产品品质,降低生产成本,从而提高工业化生产的市场竞争力。研究同时还对游动放线菌的接合转移条件进行了优化,大大提高了转化效率。     

负调节基因nsdA在链霉菌中同源性及激活沉默抗生素合成基因簇的研究

nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因。以nsdA基因片段为探针,通过Southern杂交发现nsdA存在于多种链霉菌中。根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物,扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链霉菌中nsdA基因的相似性高达77%~100%。其中变铅青链霉菌与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA序列100%一致。变铅青链霉菌通常不合成放线紫红素,中断nsdA获得的突变菌株WQ2能够合成放线紫红素;在WQ2中重新引入野生型nsdA,又失去产抗生素能力。表明nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达;nsdA的广泛存在及其序列高度保守则提示可以尝试用于这些菌种的抗生素高产育种。     

RNAi沉默lovF基因实现土曲霉一步法发酵生产辛伐他汀

辛伐他汀是重要的降胆固醇处方药物。莫那可林J是辛伐他汀合成过程的关键中间体,也是洛伐他汀生物合成的中间产物。为获得莫那可林J并通过一步法发酵生成辛伐他汀,构建了洛伐他汀生物合成关键基因lov F基因的RNAi载体p MHJ137,通过农杆菌介导的方法转化土曲霉F001,筛选整合到染色体的阳性菌,并在阳性菌株MJ1-24的发酵过程中加入了DMB-S-MMP验证其直接合成辛伐他汀的效率。结果显示MJ1-24不再产生洛伐他汀,产物中仅有莫那可林J累积。如果在发酵过程中加入前体物质,可得到产物辛伐他汀。综上,RNAi技术能够有效实现土曲霉基因沉默。此项技术推进了一步法发酵生产辛伐他汀的工艺开发。     

过表达腺苷生物合成正相关基因GlPNP提高灵芝腺苷的含量

【背景】灵芝被纳入我国“药食同源”试点名单，腺苷作为其主要活性物质之一，在免疫调节、抗炎、抗癌等方面发挥着重要作用。【目的】调控腺苷生物合成关键酶基因的表达来提高灵芝腺苷产量。【方法】将不同培养时间阶段腺苷合成酶基因(包括5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶GlATIC、嘌呤核苷磷酸化酶GlPNP、腺苷激酶GlADK)的表达量与腺苷含量相关联，筛选出与灵芝腺苷含量呈正相关的关键酶基因。克隆关键酶基因并在灵芝中过表达，探究关键酶基因过表达对灵芝腺苷积累的影响。【结果】GlPNP的表达与灵芝腺苷含量呈正相关。GlPNP的cDNA全长为969 bp，预测GlPNP蛋白的相对分子量为34.6 kDa，呈三聚体的四元结构。研究结果表明，过表达菌株中GlPNP的表达量在第4天比野生型菌株(WT)上调了2.9-3.9倍，与含空载体的菌株(CK)相比，腺苷含量分别提高了78%和63%。【结论】过表达嘌呤核苷磷酸化酶是提高灵芝腺苷产量的一种有效手段。