慢病毒介导的靶向沉默信息调节因子1（SIRT1）的RNA干扰对肝癌细胞生长及凋亡的影响

目的探讨慢病毒介导的靶向SIRTlshRNA对肝癌细胞生长和凋亡的影响。方法Western印迹分析SIRT1在多个肝癌细胞系中的表达;通过慢病毒介导的shRNA干扰技术靶向沉默SIRT1的表达,并通过Western印迹验证SIRTl基因的沉默效果。台盼蓝排斥实验分析SIRT1基因沉默对肝癌细胞生长的影响;流式细胞术和Western印迹检测PARP蛋白的剪切物观察细胞凋亡状态。结果SIRT1在多个肝癌细胞系中表达水平明显上调;慢病毒介导的shRNA能显著抑制细胞中SIRT1的表达。流式细胞术及Western印迹结果均显示SIRT1表达沉默显著诱导了肝癌细胞的凋亡。结论慢病毒介导的靶向SIRT1shRNA显著地抑制SIRT1的表达;SIRT1基因沉默抑制肝癌细胞生长并促进了细胞凋亡。     

Beclin-1 shRNA对低氧诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的：构建Beclin-1基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,感染人SH-SY5Y细胞,观察沉默Beclin-1基因后低氧对SH-SY5Y细胞自噬的影响。方法：构建特异性靶向Beclin-1基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;再将载体转染入SH-SY5Y细胞;RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达;Western blot检测Beclin-1蛋白表达;CCK-8法测定Beclin-1 shRNA对SH-SY5Y细胞活力的影响。再将空白对照、阴性对照、转染型三种细胞分别以21%常氧及5%低氧培养,Western blot检测各组细胞LC3蛋白表达;电镜观察自噬小体。结果：Beclin-1 shRNA能明显抑制SH-SY5Y细胞Beclin-1的mRNA及蛋白的表达;沉默Beclin-1基因后,Beclin-1 shRNA组细胞存活率与阴性对照组相比无差异;成功建立了稳定表达Beclin-1 shRNA的SH-SY5Y细胞。5%低氧处理后,与阴性对照组相比较,Beclin-1 shRNA组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调,细胞内自噬小体数量减少。结论：慢病毒介导的Beclin-1shRNA对SH-SY5Y细胞的活力无影响,但可以抑制低氧诱导的自噬。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZshR-NA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%。上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制研究

该文旨在探讨慢病毒介导的沉默信息调节因子6(silent information regulator 6,SIRT6)基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制。逆转录PCR(RT-PCR)和Western blot分别检测人肝癌细胞系(SK-Hep-1、Huh-7、PLC/PRF/5、Hep G2)和永生化肝细胞系(MIHA)中SIRT6基因的表达水平;利用慢病毒介导的sh RNA干扰技术靶向沉默SIRT6的表达,并通过RT-PCR和Western blot验证其沉默效率;流式细胞术检测SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响,进一步应用RT-PCR和Western blot检测SIRT6基因沉默对凋亡抑制蛋白基因(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族m RNA和蛋白质水平的影响;最后,应用流式细胞术分析X连锁凋亡抑制蛋白基因(X-linked inhibitor of apoptosis protein gene,XIAP)在SIRT6基因沉默诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。结果显示,SIRT6基因在人肝癌细胞系中表达上调;慢病毒介导的sh RNA能抑制人肝癌细胞中SIRT6基因的表达;沉默SIRT6基因的表达能诱导人肝癌细胞凋亡,并降低XIAP的m RNA和蛋白质水平;过表达XIAP能逆转SIRT6基因沉默所诱导的人肝癌细胞凋亡。该研究结果提示,SIRT6基因沉默可能通过调节XIAP的表达从而诱导人肝癌细胞凋亡。     

梅花鹿CGI99基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

利用慢病毒介导的基因沉默体系,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(AP)中CGI99基因进行RNA干扰,并初步研究该基因对细胞增殖的影响。设计出1条针对梅花鹿CGI99基因的shRNA序列与载体质粒pLVTHM连接,之后与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染HEK 293t细胞,获得重组慢病毒,感染AP细胞;通过荧光定量PCR检测CGI99基因的下调水平;通过MTT实验检测CGI99基因沉默对AP细胞增殖影响。基因的表达水平大幅度下调,干扰效率达到70.8%;MTT实验的数据曲线趋于一致。结果表明,成功构建了针对梅花鹿CGI99基因的RNAi载体并干扰了CGI99基因在AP细胞中的表达,且初步确定CGI99基因对AP细胞的增殖并无显著影响。     

慢病毒介导CD36基因沉默细胞株的构建及其对caveolin-1蛋白表达的影响

CD36作为重要的清道夫受体密切参与了巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取作用,为了进一步研究CD36的功能,本文利用慢病毒介导的shRNA干扰技术,构建了CD36基因沉默巨噬细胞(J774A.1)株,并以此为模型分析了CD36在caveolin-1蛋白表达过程中的作用。首先,针对CD36基因序列设计合成5条shRNA片段,并构建得到pLKO.1-CD36-shRNA慢病毒干扰载体,测序鉴定后与psiCHECK-Ⅱ-CD36载体共转染入293T细胞中,筛选出有效的CD36-shRNA。将慢病毒干扰载体与病毒包装质粒共转染入293T细胞,包装得到慢病毒颗粒,之后感染J774A.1细胞,经嘌呤霉素筛选后得到CD36基因沉默稳转细胞株。Western blotting及激光共聚焦检测结果表明CD36基因沉默效率达90%,并且伴随着CD36的基因沉默,与之结合的DiI-oxLDL也随之大幅降低,证明构建成功具有良好生物学活性的CD36基因沉默细胞株。最后,抑制剂处理及oxLDL给药刺激实验结果表明,CD36的基因沉默能够显著降低JNK及ERK的磷酸化水平,进而抑制了caveolin-1的蛋白表达,表明CD36能够经由JNK及EKR信号传导调节caveolin-1的蛋白表达。     

慢病毒介导的靶向NDV P基因shRNA对NDV复制的抑制作用

小干扰RNA(siRNA)诱导的RNA降解可以特异性地抑制病毒感染,它作为一种有效的抗病毒治疗方法正被广泛研究。为了探讨慢病毒介导的shRNA对NDV复制的抑制效果,从而为新城疫病毒的抗病毒研究奠定基础,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)P基因为靶基因,构建了靶向NDV P基因的shRNA重组慢病毒表达载体RNAi-341和RNAi-671。将其与辅助细胞共转染293T细胞,获得包装好的重组慢病毒;在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)和SPF鸡胚上进行了干扰实验,并通过荧光定量PCR和病毒滴度测定检测shRNA对NDV的抑制效果。结果发现,RNAi-341和RNAi-671均能抑制FLAG-P蛋白在293T细胞中的瞬时表达。在CEF细胞感染后16h后,NDV的病毒滴度分别降低了66.6倍和30.6倍;在鸡胚感染48h后,RNAi-341和RNAi-671组NDV病毒的增殖量分别减少99%和98%。RNAi-341与RNAi-671不仅能抑制P基因的转录,还能显著降低NP、M、F、HN和L基因的转录水平。与RNAi-671相比,RNAi-341的抑制效果更好。研究结果表明,慢病毒介导的靶向P基因的shRNA具有抗病毒作用,能够抑制NDV在CEF和鸡胚中的复制,从而为临床防治NDV提供一个新方法。     

鸡马立克病病毒Meq蛋白抑制p53的转录激活作用

目的　构建马立克病病毒野生型Meq基因（Meq-wt）和p53结合区域缺失的突变型Meq基因（Meq-mut）表达质粒,研究Meq蛋白对p53的转录激活功能的影响,为进一步了解其生物学功能奠定基础。方法 采用PCR方法克隆马立克氏病毒Meq-wt基因,并采用突变PCR方法缺失Meq与p53结合区域,分别构建了Meq-wt和Meq-mut基因表达质粒。转染鸡胚成纤维细胞（CEF）后,用western印迹法检测Meq蛋白的表达,利用荧光素酶报告基因系统证实Meq蛋白对p53转录激活的抑制作用。同时借助免疫荧光技术,采用荧光显微镜观察Meq蛋白与p53蛋白在细胞中的定位。结果 DNA序列测序表明克隆的Meq-wt、Meq-mut基因插入位点和核苷酸序列完全正确。荧光素酶报告基因系统证实Meq蛋白对p53转录激活的具有明显的抑制作用。间接免疫荧光试验证实野生型Meq蛋白主要在胞浆中表达,而缺失与p53结合区域的突变型Meq在胞浆/胞核中均有表达。野生型Meq蛋白与内源性p53蛋白在胞核内能够很好地重合。 结论 Meq蛋白对p53的转录激活具有抑制作用,可能是通过直接与p53相互结合,来抑制对p53转录活性功能。