凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌a-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌a-溶血素蛋白为研究对象, 分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物, Bradford法测定蛋白含量, 兔红细胞测定半数溶血效价。结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带, 达电泳级纯度。与此同时, 凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%, 蛋白含量为0.337 mg/mL, 溶血活性为1519 HU/mg; 镍柱亲和层析的纯化率为17.5%, 蛋白含量为0.35 mg/mL, 溶血活性为1463 HU/mg。由此可见, 凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。     

16S rRNA基因高通量测序方法检测奶牛场常用干草表面微生物群落结构及多样性

【目的】随着中国奶牛业的发展,干草需求量与日俱增。作为天然牧草,干草可以成为家畜传播病原体的载体。以干草表面附着物为研究对象,了解干草中细菌群落结构以及致病菌属特征。【方法】对来自6个不同奶牛场饲草舍的干草样本,应用Illumina Mi Seq高通量测序技术测定干草表面附着物细菌的16S r RNA基因V3-V4变异区序列,分析不同干草样本细菌群落组成。【结果】干草样本中的细菌在97%的相似水平下共得到OTU个数为15 416,涵盖了29门87纲144目219科323属的细菌。微生物多样性分析表明,干草样本具有很高的细菌多样性,不同样本多样性存在差异。对干草样本菌群中丰度较高的14种病原菌属进行分析,发现相较于人工种植牧草制备的干草,天然牧草制备的干草中病原菌属丰度较高。【结论】研究解析了干草样本中微生物的多样性、丰度及主要病原菌属的特征,对奶牛场疾病防控有一定指导意义。     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌粘附素基因clfa A、clfa B、fnbp A和fnbp B

利用多重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素基因clfa A、clfa B、fnbp A和fnbp B的方法,对奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株进行聚集因子主效基因的分析。通过设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌模板进行PCR扩增,将目的基因回收并连接到T载体,鉴定后进行测序验证,然后对本实验室所分离鉴定的金葡菌临床分离株进行多重PCR检测。PCR产物经过电泳成像显示,clfa A和clfa B分别在292bp和205bp处出现特异性条带;fn-bp A和fnbp B分别在524bp和642bp处出现特异性条带。通过对29株金葡菌临床分离株多重PCR检测发现:能扩增出clfa A、clfa B、fnbp A和fnbp B的分别有26株、12株、28株和3株。建立的多重PCR检测金黄色葡萄球菌粘附素基因的方法具有良好的特异性和可靠性,并且发现clfa A和fnbp A基因存在于绝大部分的金黄色葡萄球菌中。     

Zfb株牛源金黄色葡萄球菌生物学特性

从临床患病牛乳样内分离出的金黄色葡萄球菌β-溶血型致病菌株, 命名为zfb, 运用微生物学及现代分子生物学手段检测了该菌株的生物学特性, 以金葡菌ATCC 25923为对照株。结果表明, 金黄色葡萄球菌zfb不产生脂酶, 有抗药性, 在改良型血清软琼脂培养基中观察荚膜形态, 活体内和体外均显现散布型状态。同时, 以昆明小白鼠为动物模型, 测定了半数致死量和器官侵袭力。金黄色葡萄球菌牛源分离株zfb的半数致死率为10-4.33/mL, 参考菌株ATCC 25923菌株的半数致死率为10-2.5/mL。对牛源     

金黄色葡萄球菌a-溶血素亚单位疫苗在小白鼠模型的免疫效力评价

目的:以小白鼠为试验模型,检测金黄色葡萄球菌α 溶血素基因工程蛋白单位疫苗的抗体效价水平和免疫保护力,初步评价此亚单位疫苗的免疫效力。方法:Bradfrod法对目的蛋白进行蛋白含量测定,Geoffroy法测定目的蛋白半数溶血效价和活性,建立ELISA方法测定抗体效价,并且通过攻毒得出疫苗免疫保护力。结果:纯化的目的蛋白在53kDa处显示单一条带,蛋白含量为0.1278mg/ml;溶血比活为8012.5HU/mg;所有试验小鼠在首免一周后采集的血清中都检测到了特异性抗体,而抗体效价开始时呈逐渐上升趋势,达最高值后随时间延长逐渐降低。结论:纯化的目的蛋白达到电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性,蛋白疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律。     

荷斯坦奶牛中性粒细胞β-防御素cDNA的克隆与序列分析

为研发牛β-防御素生物制剂,防治奶牛乳腺炎。根据已发表的牛β-防御素基因序列设计一对引物。收集患乳腺炎奶牛乳静脉血液中性粒细胞,用试剂盒提取总RNA。经RT-PCR扩增牛β-防御素cDNA片段,回收纯化PCR产物,连接pMD18-T载体,转化感受态细胞JM109。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR及双酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为189bp,含有一个完整的ORF,能编码63个氨基酸的多肽,多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较,表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD-7编码区序列96.3%相同。结果成功克隆出奶牛β-防御素家族的成员BNBD-7基因,为重组牛β-防御素的开发奠定了基础。     

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌α-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白为研究对象,分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异.SDS-PAGE分析检测纯化产物,Bradford法测定蛋白含量,兔红细胞测定半数溶血效价,结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带,达电泳级纯度.与此同时,凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%,蛋白含量为0.337 mg/mL,溶血活性为1519 HU/mg;镍柱亲和层析的纯化率为17.5%,蛋白含量为0.35 mg/mL.溶血活性为1463 HU/mg.由此可见,凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒.     

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZshR-NA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%。上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖。     

金葡菌荚膜多糖血清型的研究进展

金葡菌是引起奶牛乳腺炎的一种主要的致病菌,致病性金葡菌多数含有荚膜成分,金葡菌荚膜多糖有11种血清型。从不同血清型荚膜多糖的结构,基因构成,抗吞噬作用,致病性等方面作了介绍,并简要介绍了金葡菌荚膜多糖血清型的国内外研究现状。     

PCR扩增血浆凝固酶基因检测致病性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌致病株能同时产生两种蛋白质,一种分泌于菌体外,另一种结合在菌体表面,它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,称为凝固酶（Coagulase）。凝固酶是检验致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。试验根据GenBank公布的血浆凝固酶序列,设计特异PCR引物,利用聚合酶链式反应扩增出金黄色葡萄球菌凝固酶基因,克隆测序,与Genbank中已公布的序列同源性达到100％,并且检测结果与用兔血浆进行血浆凝固酶实验结果完全吻合,建立了金黄色葡萄球菌性乳腺炎的快速诊断方法。