ACC氧化酶和ACC合成酶反义RNA融合基因导入番茄和乙烯合成的抑制

从番茄品种强力米寿的总DNA中克隆番茄果实特异启动子2A11,以番茄成熟果实的RNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆番茄全长的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因片段。完成两个基因的克隆和测序后,将888bp的番茄ACC氧化酶基因和943bp的ACC合成酶基因片段串联,构成全长1837bp的融合基因。将该融合基因以反义的方向插入植物双元载体pYPX145中番茄果实表达特异启动子下游,获得ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因融合的植物双元载体pOSACC。该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草SAR序列,利于转基因的稳定遗传。以番茄栽培品种合作903子叶和下胚轴为外植体,利用根癌农杆菌进行基因转化,通过200mg/L卡那霉素选择和GUS检测,获得了105株番茄GUS阳性植株,转基因番茄果实在当代表现明显耐贮特点。经过4代的耐贮和果实农艺性状的综合选择,获得了两个表现良好的株系DR-1和DR-2,两株系果实乙烯释放量显著下降,是未转基因材料的9.5%,番茄的贮存期在50天以上。     

ACC氧化酶和ACC合成酶反义RNA融合基因导入番茄和乙烯合成的抑制

从番茄品种强力米寿的总DNA中克隆番茄果实特异启动子2A11,以番茄成熟果实的RNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆番茄全长的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因片段。完成两个基因的克隆和测序后,将888bp的番茄ACC氧化酶基因和943bp的ACC合成酶基因片段串联,构成全长1837bp的融合基因。将该融合基因以反义的方向插入植物双元载体pYPX145中番茄果实表达特异启动子下游,获得ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因融合的植物双元载体pOSACC。该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草SAR序列,利于转基因的稳定遗传。以番茄栽培品种合作903子叶和下胚轴为外植体,利用根癌农杆菌进行基因转化,通过200mg／L卡那霉素选择和GUS检测,获得了105株番茄GUS阳性植株,转基因番茄果实在当代表现明显耐贮特点。经过4代的耐贮和果实农艺性状的综合选择,获得了两个表现良好的株系DR-1和DR-2,两株系果实乙烯释放量显著下降,是未转基因材料的9．5％,番茄的贮存期在50天以上。     

影响花椰菜农杆菌介导转化因素的研究

以花椰菜赛雪的带柄子叶为外植体,以MS为基本培养基,GUS基因为报告基因,分析了遗传转化过程中的影响因子,如预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、延迟筛选时间等对外植体瞬间表达和稳定表达的影响。结果显示,以花椰菜的带柄子叶为外植体,预培养2d,农杆菌菌液为OD6000.3～0.4,侵染8min,共培养2d,乙酰丁香酮浓度为100μmol/L,延迟筛选7d,卡那霉素筛选压为5mg/L为最优的遗传转化方案,转化率最高可达35.7%。另外,GUS瞬间表达率和转化率并不存在绝对的相关性,但瞬间表达分析仍然可以作为外源基因进入受体细胞的指示。花椰菜农杆菌介导转化方案的优化研究为芸薹属蔬菜高效遗传转化提供了技术保障,有利于芸薹属蔬菜遗传育种与种质创新研究。     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化

以5～7d龄的 丽春 番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg/L.通过根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLII基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组.     

甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化

以5～7d龄的“丽春”番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg／L。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLⅡ基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组。     

根癌农杆菌对巴戟天遗传转化的影响因素

以巴戟天带节茎为材料,研究了根癌农杆菌对巴戟天遗传转化的影响因素。结果表明:外植体感染前先进行2 d预培养,对转化有一定促进作用;外植体与农杆菌共培养时间以3 d为宜;乙酰丁香酮能提高转化效率,抗性芽分化率可达18.0％;外植体与农杆菌共培养后延迟4 d选择,抗性芽分化率有所提高;硝酸银能抑制外植体表面农杆菌的生长,提高GUS阳性芽的比例,硝酸银浓度2 mg/L时,GUS阳性芽比例最高(42.9％)。     

番茄子叶外植体转化系统的优化

目的 :对番茄子叶外植体的转化进行优化 ,为进行转基因番茄的研究奠定基础。方法 :通过正交设计实验 ,以子叶外植体的存活天数为观察指标 ,分别对农杆菌稀释浓度、浸染时间和转化方式等条件进行优化。结果 :在子叶预培养 2d、活化农杆菌稀释倍数约 30倍、侵染时间为 1 0min、共培养时间为 2d的情况下 ,子叶存活时间最长 ,抗性芽产生频率达 2 5 %。结论 :获得了高效的番茄子叶外植体转化系统 ,为进行基因的转化奠定了基础     

外源基因在烟草绿色组织中的高效表达研究

研究外源基因在受体绿色组织中的特异表达情况,分别构建由棉花PsbP启动子驱动的GUS基因及CP4 epsps 基因的植物表达载体pBI121-P、pBI121-PE.农杆菌介导法转化到烟草中,获得20株转pBI121栽体、40株转pBI121-P栽体和32株转pBI121-PE载体的烟草阳性植株.组织化学染色分析表明,GhPsbP启动子驱动的GUS基因只在转基因烟草的叶片和茎中表达,在根中不表达;Real-time PCR分析表明,PsbP启动子驱动CP4 epsps基因在叶和茎中的表达量分别是根中的15倍和10倍;草甘膦抗性试验证明,PsbP启动子驱动的CP4 epsps基因在烟草叶及茎的绿色组织中的表达量足以忍受1%浓度草甘膦的毒害.证明GhPsbp启动子可以有效地驱动外源基因在烟草的绿色组织中高效特异的表达.     

影响农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的因素

利用携带pCAMBIA1301质粒（含hpt和gus基因）的超毒根癌农杆菌菌株EHA105对大豆子叶节外植体进行遗传转化,研究了影响农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的因素。研究结果表明．农杆菌侵染液和共培养培养基中添加200μmok/L乙酰丁香酮和50mg／L抗坏血酸可以有效促进农杆菌对大豆子叶节的转化。农杆菌与子叶节共培养后羧苄青霉素（250mr／L）和头孢霉素（100mg／L）结合使用能有效抑制农杆菌过度繁殖并提高转化芽诱导频率;在转化细胞的分化和转化芽伸长过程中,改进的筛选策略可以明显改善对转化芽的筛选效果,从而提高转化频率。应用优化后的转化体系．获得了3个国内大豆主栽品种的转基因植株,PCR阳性植株频率为3．8％～7．6％。转化植株叶片总DNA的PCR和Southern blot实验表明,T-DNA上的外源基因已经整合到大豆基因组中。     

ocs/mas|一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。     

Fertile transgenic Brachiaria ruziziensis (ruzigrass) plants by particle bombardment of tetraploidized callus

We have produced transgenic plants of the tropical forage crop Brachiaria ruziziensis (ruzigrass) by particle bombardment-mediated transformation of multiple-shoot clumps and embryogenic calli. Cultures of multiple-shoot clumps and embryogenic calli were induced on solidified MS medium supplemented with 0.5mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2mg/L 6-benzylaminopurine (BAP) or 4mg/L 2,4-D and 0.2mg/L BAP, respectively. Both cultures were bombarded with a vector containing an herbicide resistance gene (bar) as a selectable marker and the β-glucuronidase (GUS) reporter gene. Sixteen hours after bombardment, embryogenic calli showed a significantly higher number of transient GUS expression spots per plate and callus than multiple-shoot clumps, suggesting that embryogenic callus is the more suitable target tissue. Following bombardment and selection with 10mg/L bialaphos, herbicide-resistant embryogenic calli regenerated shoots and roots in vitro, and mature transgenic plants have been raised in the greenhouse. Polymerase chain reaction (PCR) and DNA gel blot analysis verified that the GUS gene was integrated into the genome of the two regenerated lines. In SacI digests, the two transgenic lines showed two or five copies of GUS gene fragments, respectively, and integration at different sites. Histochemical analysis revealed stable expression in roots, shoots and inflorescences. Transgenic plants derived from diploid target callus turned out to be sterile, while transgenics from colchicine-tetraploidized callus were fertile.     

Breaking-off tissue specific activity of the oil palm metallothionein-like gene promoter in T1 seedlings of tomato exposed to metal ions

Metallothioneins (MTs) are cysteine-rich metal-binding proteins that are involved in cell growth regulation, transportation of metal ions and detoxification of heavy metals. A mesocarp-specific metallothionein-like gene (MT3-A) promoter was isolated from the oil palm (Elaeis guineensis Jacq). A vector construct containing the MT3-A promoter fused to the β-glucuronidase (GUS) gene in the pCAMBIA 1304 vector was produced and used in Agrobacterium-mediated transformation of tomato. Histochemical GUS assay of different tissues of transgenic tomato showed that the MT3-A promoter only drove GUS expression in the reproductive tissues and organs, including the anther, fruit and seed coat. Competitive RT-PCR and GUS fluorometric assay showed changes in the level of GUS mRNA and enzyme activity in the transgenic tomato (T₀). No GUS mRNA was found in roots and leaves of transgenic tomato. In contrast, the leaves of transgenic tomato seedlings (T₁) produced the highest GUS activity when treated with 150 μM Cu²⁺ compared to the control (without Cu²⁺). However, Zn²⁺ and Fe²⁺ treatments did not show GUS expression in the leaves of the transgenic tomato seedlings. Interestingly, the results showed a breaking-off tissue-specific activity of the oil palm MT3-A promoter in T₁ seedlings of tomato when subjected to Cu²⁺ ions.     

LE-ACS6启动子在LE-ACS6::GUS转基因拟南芥中的特异性

通过对不同发育时期LE-ACS6::GUS转基因拟南芥中GUS表达特异性的研究,证明LE-ACS6基因的启动子在拟南芥中也表现启动参与第一系统乙烯合成的关键酶基因的活性.在转基因拟南芥中,LE-ACS6启动子还表现响应外源生长素处理、伤害处理等多种刺激因子的特点.     

植物激素和抗生素调节的转基因火炬松愈伤组织的生长和分化

包含质粒载体pBI121的农杆菌菌株LBA4404被用于转化火炬松的成熟合子胚。质粒载体pBI121含有胭脂碱合成酶基因的启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ)和花椰菜花叶病毒的35S启动子驱动的GUS基因。器官发生的转基因愈伤组织和转基因的再生植株已经获得,并经GUS组织化学染色、聚合酶链式反应和Southern杂交分析证实。植物激素（BA/IBA）和抗生素对转基因愈伤组织的生长和分化的影响被研究。500mg/L羧苄青霉素和2mg/LBA、0.5mg/L IBA的组合导致转基因愈伤组织的生长增加54.2%,分化增加45.7%。500mg/L Claforan和2mg/L BA、0.5mg/L IBA的组合导致转基因愈伤组织的生长增加40.8%,分化增加38.7%。高浓度的植物激素和抗生素降低了转基因愈伤组织的生长和分化。实验结果有助于建立一个高效的农杆菌介导的火炬松遗传转化系统,也有助于未来针叶树的遗传转化研究。