莴苣属蔬菜资源SRAP标记PCR体系的构建与优化

以莴苣为材料研究了影响SRAP标记PCR结果的因素,包括Mg^2＋、dNTP、引物、Taq酶的浓度以及退火温度等,建立了适用于莴苣属蔬菜SRAP分析的PCR反应体系：在20μl反应体系中,模板DNA为50ng,Mg^2＋浓度为2．0mmol／L,dNTP浓度为0．2mmol／L,引物浓度为0．75μmol／L,Taq酶用量为1U。适宜的扩增程序为94℃5min;94℃1min,35℃1min,72℃1min,5个循环;94℃1min,51℃lmin,72℃1min,30个循环;72℃7min。对体系的验证结果表明本研究建立的莴苣SRAP体系重复性好、分辨率高、多态性丰富,在莴苣属蔬菜种盾资源评价、分子标记辅助选择言种等骞方面躲有专耍作用。     

简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选

以豆科沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus)的基因组DNA制备ISSR-PCR模板。通过对聚合酶链式反应（PCR）体系中模板DNA浓度,Mg^2 浓度,dNTP的用量,Taq酶的含量以及退火温度梯度进行试验。探讨筛选出清晰,多态性高,可重复性好的ISSR引物的PCR反应条件,用100个ISSR引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的15个引物,得到121个位点,其中43个多态位点,多态位点比例为36%。     

红曲菌基因组DNA提取及RAPD反应体系优化

为了建立一套适合红曲属真菌RAPD反应的优化体系,用改进的CTAB法提取红曲菌基因组DNA,采用单因素试验探讨RAPD反应体系中模板DNA、随机引物、Taq酶、Mg^2＋、dNTPs对扩增结果的影响。结果在20μL体积中,模板DNA20 ng、随机引物0、2μmol/L、Taq酶、Mg^2＋1.5mmol/L,dNTPs 1mmol/L的反应体系可得到稳定清晰的RAPD扩增图谱,为采用RAPD技术进行红曲菌种质资源遗传多样性研究奠定基础。     

白色念珠菌RAPD反应体系优化的研究

建立白色念珠菌RAPD的最佳反应体系,并应用于其基因组DNA扩增。通过单因子试验分别研究了Mg^2＋、dNTPs、Taq酶、引物和模板DNA等浓度对RAPD反应的影响;同时,应用L16（4^5）正交试验研究了DNA模板、Mg^2＋、Taq酶、dNTPs和引物浓度对RAPD反应的影响。以条带稳定、丰富、清晰为标准,获得了白色念珠菌基因组DNA的RAPD扩增优化条件;对于白色念珠菌的最适RAPD反应体系为Mg^2＋1．5mmol／L、dNTPs250μmol／L、引物0．6μmol／L、模板100ng／25μL、TaqDNA聚合酶1．5U／25μL。     

正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25（5^6）对东亚砂藓（Racomitrium japonicum）DDRT—PCR反应体系的6因素（Mg^2＋、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶）在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系（20μL）为：Mg^2＋2．25mmol／L、dNTP0．4mmol／L、锚定引物1．0μmol／L、随机引物0．7μmol／L、模板DNA1．6μL、Taq酶2．5U。对东亚砂藓DDRT—PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45．4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。     

甲肝病毒减毒株(H2)RNA的全长RT-PCR扩增

通过RT-PCR技术扩增了甲肝病毒减毒株(H₂)全长RNA,并对长片段RT-PCR扩增进行了方法学上的探讨.采用抗血清特异沉淀病毒;盐酸胍-酸性酚、氯仿一步法分离纯化病毒RNA,可得到高质量的RNA样品;以此RNA为模板,在无RNA酶的逆转录酶作用下,合成单链cDNA;继续以此cDNA为模板,利用32 mer寡核苷酸引物, 在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增,得到7.4 kb的扩增产物.     

正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系

为了对狗牙根进行SSR-PCR分子标记分析,本研究对狗牙根的SSR-PCR反应体系进行了优化,利用L16(45)正交设计对狗牙根SSR-PCR反应体系中的Taq酶、Mg~(2+)、dNTPs和引物4个因素的多个水平进行了筛选,PCR结果用SAS进行方差分析,并利用筛选出的最优体系对退火温度进行了筛选。结果表明:(1)Taq酶、Mg~(2+)和引物3个因素对狗牙根SSR-PCR扩增结果有极显著影响,影响程度为Taq酶Mg~(2+)引物,而d NTPs对扩增结果影响不显著;(2)筛选出了20μL的狗牙根SSR-PCR最优反应体系为0.5 U Taq酶、2 mmol/L Mg~(2+)、0.4μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs、30~60 ng模板DNA;(3)退火温度50~62℃对本试验所选引物的SSR-PCR扩增结果影响不大,本研究选用55℃作为退火温度。     

缢蛏SRAP-PCR体系的正交优化

运用L16(45)正交设计对影响缢蛏SRAP-PCR反应的5个因素:Taq酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、dNTPs浓度和引物浓度在4个水平上进行了优化试验,PCR结果采用SPSS v16.0软件分析.结果表明,各因素对SRAP-PCR反应的影响依次为:引物>Taq酶>模板DNA>Mg2+;缢蛏SRAP反应最佳体系为:在20μL PCR反应体系中,引物0.3 μmol/L、Taq 酶0.5 U、模板DNA 50 ng、dNTPs 0.2 mmol/L及Mg2+2 mmol/L.用不同缢蛏的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,8对引物均能扩增出清晰且重复性好的谱带.因而建立的缢蛏反应体系稳定可靠.     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

均匀设计优化建兰ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响建兰ISSR-PCR体系的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化,建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,舍引物0．25μmol／L、Mg^2＋ 2．5mmol／L,dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA40ng．在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选．筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min;接着进行32个循环：94℃变性35S,52～56℃退火45S,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min．同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物．     

早熟砂梨ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以我国南方主栽的早熟砂梨品种‘翠冠’Pyrus pyrifolia ‘Cuiguan’为材料,对ISSR技术体系中的模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、退火温度、PCR循环数等7个主要因素进行优化和筛选,建立了适合早熟砂梨的ISSR-PCR反应体系。最终反应体系为20 μL体系中10×PCR buffer（不含Mg2+）2 μL,模板DNA浓度60 ng,TaqDNA聚合酶0.75 U,引物浓度1 μmol/L,dNTP浓度90 μmol/L,Mg2+浓度2.25 mmol/L。扩增程序为：预变性94 ℃ 5 min,变性94 ℃ 45 s,退火45 s,72 ℃延伸1 min,共42个循环,然后72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测多态性。     

怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

岩白菜ISSR-PCR反应体系的优化

目的:优化岩白菜ISSR-PCR反应体系,为利用ISSR标记进行岩白菜遗传多样性研究服务。方法:采用5因子4水平正交设计法优化岩白菜ISSR-PCR反应体系。结果:五个因子从大到小的影响力排序结果为:dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物=Taq酶。岩白菜ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积25μL,内含10×PCR缓冲液2.5μL、2.5 mmol.L-1Mg2+、2.0 U Taq酶、0.2 mmol.L-1dNTPs、0.48μmol.L-1ISSR引物、125 ng模板DNA。结论:研究获得的最佳反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,为利用ISSR标记技术研究岩白菜遗传多样性奠定了基础。     

怀地黄ISSR扩增条件优化的研究

用CTAB法提取怀地黄嫩叶DNA,进行简单重复间序列标记(ISSR)分析.通过单因子实验分别研究了退火温度、Taq酶单位、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,找出各自的合适条件,而且每一个合适条件确定以后都被作为后续研究的一个条件.通过各个因子的组合研究建立了适宜于怀地黄ISSR分析的扩增体系25 μL PCR反应体积,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.1% Trion X-100,pH9.0 ),2.5 mmol/L MgCl2,1.5～1.0 U Taq酶,60 ng模板DNA,0.4 μmmol/L引物,各0.4 mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP.合适的退火温度为53～55℃.为用ISSR技术分析鉴定怀地黄种质资源奠定了良好的基础.     

云南松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜云南松SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用近缘种火炬松的引物,采用正交设计L16(45)对云南松SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了适于云南松的SSR反应体系.在10μL的反应体系中,模板DNA的用量为30.0 ng,Taq DNA聚合酶的用量为1.0 U,Mg2+的浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物的浓度为0.2 μmol/L.扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,48℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃延长10 min,4℃保存.最后利用1个居群对该体系进行稳定性验证,结果可用于云南松SSR标记的研究.     

华顶杜鹃ISSR反应体系的优化及亲缘关系的初步分析

以华顶杜鹃为材料,利用单因素试验确立适合华顶杜鹃ISSR-PCR的优化反应体系:在25μL反应体系中,Mg2+1.5或2.0mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,引物0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶lU,模板DNA 40ng;分析ISSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度对ISSR-PCR反应的影响。PCR扩增程序:预变性94℃ 3min;变性94℃ 45s;退火(Tm+2)℃(根据引物不同设定)75s;延伸72℃ 1.5min;40个循环;继续延伸72℃ 10min;1.5%琼脂糖电泳分离PCR产物。并以优化好的体系初步分析华顶杜鹃及5个近缘种(茶绒杜鹃、Rhododendron mayebrae、Rh.sataense、南平杜鹃和映山红)的亲缘关系,6个种明显地聚为2大类:A类含有映山红、南平杜鹃;B类含有茶绒杜鹃、Rh.sataense、Rh.mayebrae与华顶杜鹃,为明确华顶杜鹃的系统地位提供可借鉴的依据。     

朝鲜碱茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究,以野生朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)为材料,通过单因子试验对ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的PCR反应体系:在20μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,MgCl22.5 mmol/L和10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL。此外,还筛选到10条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。     

美国黑核桃SSR反应体系优化

优化SSR-PCR反应体系是黑核桃（Juglans nigra L.）SSR基因鉴定和群体遗传等研究的基础。本研究通过对PCR反应中Mg²⁺浓度、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）浓度、Taq聚合酶用量、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA量的组合以及PCR程序组合试验,确定了黑核桃SSR的最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）,0.25 mmol·L^-1 dNTPs,1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺ 1 μL 10X Taq DNA聚合酶反应缓冲液,0.5 U Taq聚合酶,1.0 mmol·L^-1单对引物（0.5 mmol·L^-13对引物）。SSR-PCR反应扩增程序为：94℃变性3 min;93℃变性15 s,50℃或者53.5℃退火1 min,72℃延伸30 s,32个循环;72℃后延伸10 min,置4℃保存。利用此反应体系对黑核桃进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,适合进一步对黑核桃群体遗传、基因型鉴定和分子生态研究。