乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究

本研究根据已知的乙脑病毒(JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT-PCR 技术,一次扩增出了JEV的全长cDNA,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游.阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功.其次,合成一条含有 RNA聚合酶启动子序列的5′引物,利用长模板RT-PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录.转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变.收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法.本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT-PCR快速制备JEV感染性RNA的方法,将为JEV 分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础.     

麻疹病毒全长cDNA构建及其感染性的研究

为发展新型疫苗和改造目前使用的麻疹病毒疫苗,以麻疹病毒疫苗株为模板,构建了具有感染性的麻疹病毒cDNA克隆.用RT-PCR分6段扩增出麻疹病毒全长基因,通过酶切、拼接构建麻疹病毒疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列,并精确地置于T7启动子控制下与丁型肝炎病毒核酶序列之前.克隆麻疹病毒CC-47株蛋白N、P、L编码区质粒并置于T7启动子控制下,用4个质粒共转染哺乳动物细胞,在表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3的作用下进行病毒拯救.经免疫荧光、PCR等方法检测证实,获得了具有感染性的麻疹病毒.所拯救的病毒在哺乳动物细胞连续传3代后,仍能检出病毒抗原和核酸.     

RT-PCR克隆人纤溶酶cDNA大片段

目的:以人胎儿肝脏总RNA为模板,克隆人纤溶酶(plasmin)cDNA大片段。方法:采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA,RT-PCR技术获取目的基因。结果:成功地扩增出1.74kb的人纤溶酶基因,并研究了扩增人纤溶酶cDNA大片段的特定实验条件。结论:为克隆cDNA大片段研究提供了简便、快速的方法。     

登革热病毒基因组末端cDNA的克隆及序列分析

采用磁性分离技术从登革热病毒(D2-04株)感染的C6/36细胞中分离了D2-04病毒RNA.以该RNA为模板进行RT-PCR,分别扩增了D2-04 RNA 5′和3′端cDNA片段,该cDNA片段分别克隆到pGEM-3Z质粒多聚接头的HincⅡ位点得到含有5′端284 bp及3′端525 bp cDNA的重组质粒.通过荧光标记引物及双脱氧核苷酸PCR方法测定了上述cDNA插入片段的序列.同源性比较结果证明D2-04株与其他不同株间的同源性较高,可达93%～98%;不同型间的同源性较差, 仅80%左右; 属间的同源性更低.     

用磁性分离RNA直接进行逆转录PCR

逆转录PCR(RT-PCR)技术是将提取的IRNA先逆转录为cDNA,然后再对该cDNA进行PCR扩增。该技术不仅可用于各种内源及外源性正常及异常RNA的分析或检测,而且还常用于cDNA文库的构建及特定基因的制备。RT-PCR所用RNA模板一般是未经纯化的总RNA,若RNA模板含量较低便难以     

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

用建立表达性文库的方法 ,构建了Eimeriatenella孢子化卵囊噬菌体ZAP表达性cDNA文库。首先用TRIzol试剂盒从E .tenella孢子化卵囊中提取总RNA ,再用Oligo(dT)₁₂纤维素柱从总RNA中分离mRNA ,以mRNA为模板 ,Oligo(dT)₁₈Linker Primer为引物 ,反转录合成cDNA第一链 ,再在DNA聚合酶Ⅰ作用下置换合成第二链cDNA。cDNA第二链合成后用PfuDNA聚合酶补平XhoⅠ位点 ,再与EcoRⅠAdapters连接 ,经XhoⅠ酶切后 ,凝胶电泳回收 500bp～4.0kp之间的cDNA片段 ,纯化后的双链cDNA与载体ZAPExpressvector连接。体外包装后得到E .tenella孢子化卵囊的cDNA表达性文库 ,经测定该文库的容量为 6×10⁶ ,扩增后文库的滴度为 1×10¹¹ Pfu mL ,经PCR测定 ,该文库的重组率为 96%。     

登革病毒2型全长cDNA感染性转录体的构建和鉴定

为构建登革病毒感染性克隆, 针对登革病毒2型基因组全长cDNA的体外转录方法及感染性转录体进行研究。采用长链RT-PCR技术, 扩增DEN2 NGC株全长基因组cDNA, 以之为模板, 用SP6 RNA聚合酶系统制备体外转录RNA转录体, 分别经乳鼠脑内接种及电穿孔转染BHK-21细胞, 观察其感染效应。并从受染鼠脑和病变细胞中提取总RNA, 进行RT-PCR扩增、克隆测序以及电镜观察。结果发现, 从感染鼠脑和细胞中经RT-PCR均可扩增出病毒特异的基因片段, 大小与预期一致; 并从乳鼠脑组织和BHK-21细胞中观察到恢复病毒颗粒。上述结果表明本文成功构建的DEN2 NGC株病毒全长cDNA的体外转录体具有感染性, 乳鼠脑内接种途径与电穿孔转染细胞一样可成为体外转录体感染宿主细胞、获得恢复病毒的方法。     

里氏木霉纤维二糖酶bgl II基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行 RT-PCR合成约1.4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型表达载体pJW2中,经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子,温度诱导后,经酶活测定,bgl II基因在大肠杆菌中得到了表达,酶活为0.75IU/mL.     

落叶松cDNA扩增因素优化组合的研究

为了探讨落叶松cDNA扩增因素优化组合,以落叶松总RNA为模板逆转录为cDNA,然后进行PCR扩增,采用四因素三水平正交试验设计,分析比较了几种因素对PCR扩增的影响,结果显示,主要影响因素是Taq酶和Mg^2 ,随机引物和dNTP的影响较小,不同水平的影响作用是：Taq酶以高水平,即用量为2U,Mg^2 以中低水平,即用量为1.5-2.0mmol/L,可以得到多而清晰的条带;反之,则扩增效果差。     

人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达

用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以人肝细胞总RNA为模板, 扩增了人锰超氧化物歧化酶(hMnSOD)的cDNA片段, 将此cDNA克隆到载体pGEM-T中.对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定, 确定为含hMnSODcDNA的重组质粒将该hMnSODcDNA重组到表达载体pBV220内, 重组质粒在大肠杆菌DH5-α中表达hMnSOD, 表达产物占菌体总蛋白的14%, 具有持异性SOD酶活性.     

肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较

本文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量PCR（q-RT-PCR）的方法。 比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(Oligo dT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶（Taq聚合酶、Pfu聚合酶、LA taq聚合酶、Prime Star聚合酶）进行长片段基因克隆的能力及效率;同时,该研究比较了不同质量总RNA对有效进行q-RT-PCR与长片段分子克隆的影响。新建立的RNA提取方法使得RNA完整性和均一性提高。RNA的完整性及均一性对长片段cDNA的克隆至关重要。部分降解的组织RNA及细胞RNA仅适合于q-RT-PCR检测mRNA的表达水平,而不适合于cDNA的克隆。     

利用Taq DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究

应用Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus DNA polymerase)直接对RNA进行反转录成cDNA第一链,然后用特异引物进行PCR扩增,结果表明,反转录达到AMV逆转录酶的效果,且可能得到比AMV逆转录酶更完整的cDNA第一链。     

Optimizing Taq Polymerase Concentration for Improved Signal-to-Noise in the Broad Range Detection of Low Abundance Bacteria

Background

PCR in principle can detect a single target molecule in a reaction mixture. Contaminating bacterial DNA in reagents creates a practical limit on the use of PCR to detect dilute bacterial DNA in environmental or public health samples. The most pernicious source of contamination is microbial DNA in DNA polymerase preparations. Importantly, all commercial Taq polymerase preparations inevitably contain contaminating microbial DNA. Removal of DNA from an enzyme preparation is problematical.

Methodology/Principal Findings

This report demonstrates that the background of contaminating DNA detected by quantitative PCR with broad host range primers can be decreased greater than 10-fold through the simple expedient of Taq enzyme dilution, without altering detection of target microbes in samples. The general method is: For any thermostable polymerase used for high-sensitivity detection, do a dilution series of the polymerase crossed with a dilution series of DNA or bacteria that work well with the test primers. For further work use the concentration of polymerase that gave the least signal in its negative control (H₂O) while also not changing the threshold cycle for dilutions of spiked DNA or bacteria compared to higher concentrations of Taq polymerase.

Conclusions/Significance

It is clear from the studies shown in this report that a straightforward procedure of optimizing the Taq polymerase concentration achieved “treatment-free” attenuation of interference by contaminating bacterial DNA in Taq polymerase preparations. This procedure should facilitate detection and quantification with broad host range primers of a small number of bona fide bacteria (as few as one) in a sample.