SARS病毒N蛋白、E蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

本研究通过RT-PCR反应获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(E)基因,将n基因和e基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX KG上,并在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,表达产物经亲和层析纯化.重组蛋白N与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和早期诊断奠定基础     

SARS病毒N蛋白、E蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

本研究通过RT-PCR反应获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(E)基因,将n基因和e基因克 隆到大肠杆菌表达载体pGEX-KG上,并在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,表达产物经亲和层析纯化。重 组蛋白N与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和早期诊断奠定基础     

重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者血清发生特异反应

N蛋白是SARS CoV病毒基因组编码病毒核衣壳蛋白 ,它不同于现已知的任何蛋白质 .对它的深入研究对揭示SARS -CoV的致病机理和疫苗及诊断试剂的研制有重要意义 .灭活的病毒经逆转录后 ,用根据已知的病毒的基因组序列所设计的引物PCR扩增N蛋白基因 .扩增出的基因经序列分析表明和已知的序列完全一致 ,共编码 4 2 2个氨基酸残基 .将N蛋白基因克隆入原核表达载体pET2 8a构建成表达质粒pET2 8a N .表达质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,并用IPTG诱导后 ,获得了高表达N蛋白的重组菌株 .目的蛋白经一步金属离子螯合层析纯化后获得了纯度超过 90 %的样品 .Western印迹及ELISA分析表明 ,SARS患者体内有特异性的针对N蛋白的抗体 ,并具有较高的特异性 .这为临床上诊断SARS患者提供了新方法 ,并为SARS疫苗的研制提供了研究思路     

SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达

利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或／和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15％～30％之间。分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性最好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同—：活性水平。由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的。     

SARS—CoV N蛋白与病毒mRNA相互作用的初步研究

SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新型的冠状病毒,其基因组大小约为30,000 nt,为单股正链RNA。病毒基因中的1-72个核甘酸为前导序列。核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白,它在病毒基因转录,翻译以及病毒颗粒包装中起重要作用。在本研究中,我们通过PCR的方法从SARS-CoV cDNA中克隆N基因,将基因克隆到大肠杆菌表达载体中,经表达纯化获得大量重组蛋白,通过亲和层析和凝胶过滤层析获得高纯度的N蛋白。同时构建前导RNA的转录模板,经体外转录得到地高辛标记的RNA。使用Northwestern分析技术,我们证实纯化的N蛋白在体外可以与RNA发生特异性的结合。N蛋白与病毒RNA的结合特性及其在病毒生活周期中的所起作用的初步研究,为下一步设计出有效的阻断病毒周期从而达到抗病毒目的的药物或疫苗奠定了基础。     

SARS-CoV N蛋白与病毒mRNA相互作用的初步研究

SARS冠状病毒(SARS-CoV)是一种新型的冠状病毒,其基因组大小约为30,000 nt,为单股正链RNA.病毒基因中的1-72个核甘酸为前导序列.核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白,它在病毒基因转录,翻译以及病毒颗粒包装中起重要作用.在本研究中,我们通过PCR的方法从SARS-CoV cDNA中克隆N基因,将基因克隆到大肠杆菌表达载体中,经表达纯化获得大量重组蛋白,通过亲和层析和凝胶过滤层析获得高纯度的N蛋白.同时构建前导RNA的转录模板,经体外转录得到地高辛标记的RNA.使用Northwestern分析技术,我们证实纯化的N蛋白在体外可以与RNA发生特异性的结合.N蛋白与病毒RNA的结合特性及其在病毒生活周期中的所起作用的初步研究,为下一步设计出有效的阻断病毒周期从而达到抗病毒目的的药物或疫苗奠定了基础.     

狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的原核表达及鉴定

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV) 核衣壳(N)蛋白基因抗原性好的高保守基因片段,将其TA克隆至pMD18-T载体中,再利用酶切、连接的方法将测序正确的N基因目的片段亚克隆到原核表达载体pET24b中6×His Tag编码基因的上游,并将该重组质粒转化大肠杆菌Rosetta 2 (DE3)株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE 分析和Western blot 分析的结果显示,表达产物的分子质量为15 kD,与CDV标准阳性血清呈阳性反应,间接ELISA结果也表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效区分CDV标准阳性与阴性血清,表明大肠杆菌表达的CDV N 蛋白在免疫原性上具有与天然N蛋白同样的特性,可作为检测CDV的间接ELISA包被抗原。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

预防SARS病毒核酸疫苗的构建

本研究通过反转录-PCR获得了SARS冠状病毒辐条样蛋白、核衣壳蛋白和膜蛋白基因,将所获得的可能与免疫保护相关的基因克隆至核酸疫苗表达载体pcDNA-ThyA中,酶切及序列分析结果均表明载体构建正确,该候选DNA疫苗已用于动物免疫实验。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达*

本试验参照GenBank公布的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)VR2332株的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,应用RT-PCR方法扩增出了PRRSV的核衣壳蛋白基因(N基因).在对N基因及pET32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pETN.将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后,对培养条件及诱导表达条件(IPTG最佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因的高效表达.     

SARS-CoV核衣壳蛋白的表达与免疫研究

依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成编码SARS病毒N蛋白的全基因(1296bp)序 列,再与设计的CTL特异性表位基因(195bp)重组后,克隆到pET-28a( )质粒中,重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达。利用SARS患者恢复期阳性血清,鉴定表达蛋白。进一步纯化后免疫马,并用ELISA方法检 测血清抗体效价。结果显示SDS-PAGE表明所表达的蛋白相对分子质量约为55000 Da,与预计大小相符;Western blot显示表达的蛋白具有良好的抗原性和特异性。对表达蛋白形成的包涵体进行洗涤,得到的蛋白纯度可达到 70．1％。切胶纯化免疫马后,获得的抗SARS抗体滴度达1:2560。为亚单位疫苗研制和精制抗SARS抗体免疫制 剂提供基础。     

Antisense downregulation of SARS-CoV gene expression in Vero E6 cells

BACKGROUND: Severe acute respiratory syndrome (SARS) is caused by a novel coronavirus (SARS-CoV). It is an enveloped, single-stranded, plus-sense RNA virus with a genome of approximately 30 kb. The structural proteins E, M and N of SARS-CoV play important roles during host cell entry and viral morphogenesis and release. Therefore, we have studied whether expression of these structural proteins can be down-regulated using an antisense technique. METHODS: Vero E6 cells were transfected with plasmid constructs containing exons of the SARS-CoV structural protein E, M or N genes or their exons in frame with the reporter protein EGFP. The transfected cell cultures were treated with antisense phosphorothioated oligonucleotides (antisense PS-ODN, 20mer) or a control oligonucleotide by addition to the culture medium. RESULTS: Among a total of 26 antisense PS-ODNs targeting E, M and N genes, we obtained six antisense PS-ODNs which could sequence-specifically reduce target genes expression by over 90% at the concentration of 50 microM in the cell culture medium tested by RT-PCR. The antisense effect was further proved by down-regulating the expression of the fusion proteins containing the structural proteins E, M or N in frame with the reporter protein EGFP. In Vero E6 cells, the antisense effect was dependent on the concentrations of the antisense PS-ODNs in a range of 0-10 microM or 0-30 microM. CONCLUSIONS: The antisense PS-ODNs are effective in downregulation of SARS. The findings indicate that antisense knockdown of SARS could be a useful strategy for treatment of SARS, and could also be suitable for studies of the pathological function of SARS genes in a cellular model system.     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白在酵母中的表达与活性检测

用PCR扩增SARS冠状病毒N蛋白全长cDNA,克隆到酵母表达载体pPIC3.5K,构建pPIC3.5K-SCoVN酵母表达质粒。表达质粒线性化后电转化到毕赤酵母GS115中,经G418-RDB, MM/MD平板与PCR扩增筛选获得His⁺ Mut⁺ 重组菌株。比较研究了不同的培养基、溶解氧以及甲醇浓度对菌株生长与重组蛋白表达的影响。结果表明：FBS培养基最适宜重组菌的生长与表达,溶氧对菌体的生长与表达有显著的影响,甲醇诱导最佳终浓度为1％（V/V）,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量,发现重组N 蛋白表达量占细胞总蛋白的6％,每升培养基可以生产410mg重组N蛋白,生物量达45OD600。Western　blotting结果表明,重组N 蛋白对鼠源单克隆抗体以及SARS病人恢复期血清具有较强的特异性反应。对摇瓶培养条件进行了发酵罐放大实验,结果生物量达到348OD600,表达量达到 2.5g/L,分别为摇瓶表达的7.7倍和6.1倍,为SARS早期血清学诊断研究以及为N蛋白在病毒复制以及致病机理的研究奠定了一定的基础。     

血中检测SARS冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用

为明确严重急性呼吸综合症(SARS)冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用,通过微量中和试验及酶联免疫方法、间接免疫荧光法检测疑似病人恢复期血清(大于28天)中SARS-IgG抗体,确诊SARS患者。同时收集发病不同时期SARS及普通发热病人血清,利用酶联免疫方法检测SARS-CoVN蛋白,并与荧光定量PCR早期诊断方法相比较。共检测：广州地区2003年12月～2004．年1月新发4例确诊SARS患者不同时期的血液和咽漱液标本;恢复期血清SARS-CoV中和抗体阳性病人不同时期的血清46份;广州地区2003年1月～4月临床确诊SARS患者159例的血清和56例疑似患者血清;非SARS普通发热病人血清97份;正常人体检血清100份。结果：4例新发SARS患者的不同时期标本中,3例患者急性期血均检出N蛋白,优于常用的荧光定量PCR检测方法。46份SARS-CoV中和抗体阳性的血清标本,N蛋白检出率为100％。159例临床确诊病例中,发病早期5天以内SARS-CoVN蛋白的检出率为92．3％,随后呈现逐步下降的趋势,在发病第18天仍可检出。56例临床疑似患者发病早期也有23．2％检出率。而97例普通发热病人及100份正常人血清中均未能检测出SARS-CoVN蛋白。表明在血清中检测SARS冠状病毒N蛋白的方法敏感性和特异性都好,对SARS实验室早期诊断具有重要作用。     

The epitope study on the SARS-CoV nucleocapsid protein

The nucleocapsid protein (N protein) has been found to be an antigenic protein in a number of coronaviruses. Whether the N protein in severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV) is antigenic remains to be elucidated. Using Western blot and Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), the recombinant N proteins and the synthesized peptides derived from the N protein were screened in sera from SARS patients. All patient sera in this study displayed strong positive immunoreactivities against the recombinant N proteins, whereas normal sera gave negative immunoresponses to these proteins, indicating that the N protein of SARS-CoV is an antigenic protein. Furthermore, the epitope sites in the N protein were determined by competition experiments, in which the recombinant proteins or the synthesized peptides competed against the SARS-CoV proteins to bind to the antibodies raised in SARS sera. One epitope site located at the C-terminus was confirmed as the most antigenic region in this prot     

Analysis of severe acute respiratory syndrome coronavirus structural proteins in virus‐like particle assembly

SARS‐CoV has four major structural proteins: the N, S, M, and E proteins. To investigate the mechanism of SARS‐CoV assembly, we cloned the genes encoding these four proteins into the eukaryotic expression vector pCAGGS and transfected them into 293T cells. When all four expression vectors were co‐transfected VLP formed, as confirmed using electron microscopy. Using a rabbit polyclonal antibody specific to the N protein, N‐protein‐containing particles similar in size to the VLP were also observed by immunoelectron microscopy, indicating that the VLP contained the N protein. Co‐immunoprecipitation analyses demonstrated an interaction between the N and M proteins, suggesting that N protein binds directly to M protein to be incorporated into VLP.     

严重急性呼吸综合征患者血清特异性抗体消涨规律的长期追踪研究

目的:追踪检测SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体在严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清中的产生及其转归规律,为SARS诊断及防治提供依据。方法:对41例临床诊断SARS患者的血清进行了连续3年的检测,分别应用间接免疫荧光(IFA)检测患者血清特异性IgG抗体平均滴度,应用双抗原夹心ELISA法检测患者血清核衣壳蛋白(N蛋白)抗体的平均滴度,绘制消涨曲线,得出消涨规律。结果:应用IFA检测患者血清特异性IgG抗体与应用双抗原夹心ELISA法检测N蛋白抗体所得到的消涨规律不同,前者测得康复者血清IgG抗体滴度维持在较低水平,但后者检测35例康复者血清N蛋白抗体仍维持在较高水平。结论:SARS-CoV的N蛋白是免疫原性较强的抗原,感染3年后仍存在高滴度抗体;抗原夹心ELISA检测SARS-CoV N蛋白抗体的灵敏度较IFA方法高。