用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2Bnap全长cDNA序列

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术.本实验利用其原理,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cDNA序列。 Abstract:SOE by PCR is one of DNA shuffling technologies for molecular evolution engineering.Using the theory of SOE by PCR,the full-length cDNA sequence of pollen fertility gene MS2Bnap of Brasscia napus was amplified with three obtained fragments as templates which have part overlapping of MS2Bnap sequence.     

新型玉米种子生产技术表达载体的构建及遗传转化

本研究在GenBank中找到花粉育性恢复基因MS45、花粉致死基因ZmAA1、颜色筛选标记基因DsRed2及其特异性启动子和终止子序列,并在目的基因和植物表达载体pCAMBIA3300设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建表达载体pCAMBIA3300-MS45-DsRed2-ZmAAI,通过农杆菌介导的萌动胚遗传转化法将构建的表达载体转化到优良玉米自交系吉A001中,通过喷洒含5mg/L除草剂筛选得到397株草胺膦抗性植株,用PCR检测得到119株含有目的基因的阳性植株。结果表明,MS45-DsRed2-ZmAAI基因在玉米中得到表达。     

水稻OsMS2基因在花药发育中的功能分析

拟南芥MS2(MALE STERILITY 2)是一个调控花药花粉发育的关键基因。水稻OsMS2(Os03g07140)基因与拟南芥MS2的序列具有高度同源性。利用RNA干扰技术研究OsMS2基因在水稻花药发育过程中的功能。与野生型水稻相比, 转基因 植株营养生长阶段正常, 但雄性育性降低。转基因植株雄性育性降低与RNA干扰引起的OsMS2基因表达水平降低有关。进一步对转基因植株花药进行细胞学观察, 结果表明OsMS2基因表达水平的降低导致绒毡层细胞退化延迟, 小孢子壁的形成出现异常。扫描电镜观察结果显示, 小孢子壁光滑, 不能形成正常的外壁。以上结果表明OsMS2基因在水稻花药发育过程中起重要作用。     

水稻DsMS2基因在花药发育中的功能分析

拟南芥MS2（MALE STERILITY2）是一个调控花药花粉发育的关键基因。水稻OsMS2（Os03g07140）基因与拟南芥MS2的序列具有高度同源性。利用RNA干扰技术研究OsMS2基因在水稻花药发育过程中的功能。与野生型水稻相比,转基因植株营养生长阶段正常,但雄性育性降低。转基因植株雄性育性降低与RNA干扰引起的OsMS2基因表达水平降低有关。进一步对转基因植株花药进行细胞学观察,结果表明OsMS2基因表达水平的降低导致绒毡层细胞退化延迟,小孢子壁的形成出现异常。扫描电镜观察结果显示,小孢子壁光滑,不能形成正常的外壁。以上结果表明OsMS2基因在水稻花药发育过程中起重要作用。     

水稻OsMS2基因在花药发育中的功能分析

拟南芥MS2（MALE STERILITY2）是一个调控花药花粉发育的关键基因。水稻OsMS2（Os03g07140）基因与拟南芥MS2的序列具有高度同源性。利用RNA干扰技术研究OsMS2基因在水稻花药发育过程中的功能。与野生型水稻相比,转基因植株营养生长阶段正常,但雄性育性降低。转基因植株雄性育性降低与RNA干扰引起的OsMS2基因表达水平降低有关。进一步对转基因植株花药进行细胞学观察,结果表明OsMS2基因表达水平的降低导致绒毡层细胞退化延迟,小孢子壁的形成出现异常。扫描电镜观察结果显示,小孢子壁光滑,不能形成正常的外壁。以上结果表明OsMS2基因在水稻花药发育过程中起重要作用。     

起源于组织培养的籼稻雄性不育体细胞无性系变异

IR8及IR54的成熟种子与幼穗培养在MS培养基,蔗糖6％附加生长刺激素及其它成分的条件下,在再分化植株第一代(R_1)中各发现了1株雄性不育突变(其中来自IR54的1株为育性嵌合体)。在IR24及IR54体细胞无性系第二代(R_2)各发现1个株系分离出雄性不育与育性正常两类植株。上述雄性不育有花粉败育与无花粉型两类。IR24对无花粉型的雄性不育(来自IR54)为半恢复。F_1及R_2代的育性分离完全符合15/16∶1/16的模式,表明雄性不育为两对独立的核基因所控制。通常雄性不育是通过杂交(包括远缘与品种间)理化诱变或自发突变产生的。最近在烟草上通过原生质体融合也获得了雄性不育。但从体细胞培养的无性系及其后代中获得雄性不育的突变,本研究乃属首次。     

云烟85胞质雄性不育烟草雄蕊发生的细胞学观察

雄性不育烟草MS云烟85的雄性败育发生在雄蕊原基分化后至孢原细胞形成前,在开放花朵中常能见到败育的雄蕊,其特征是花丝缩短,花药畸形、内无花粉或花粉空瘪。与正常烟草(保持系)子房由2心皮组成不同,雄性不育烟草MS云烟85子房都由3心皮组成。     

反向PCR法扩增花粉特异表达基因PSG076启动子

PSG076基因是从奥地利小麦品种‘Ferdinand’中分离的花粉特异性表达基因,功能未知.为获得可用于小麦基因工程的花粉特异性启动子,采用优化的反向PCR法分离PSG076启动子,获得了起始密码子上游约1.4 kb的启动子序列.生物信息学分析显示,该启动子除含有与花粉特异性表达相关的调控元件AGAAA和GTGA外,还含有花粉特异性表达相关的数量元件AGGTCA和AAATGA,推测其为活性较强的花粉特异性启动子.实验中对反向PCR方法的优化可提高扩增侧翼未知序列的效率,特别适用于启动子序列的扩增.     

文心兰不育花粉粒形态观察及相关基因克隆与表达分析

该研究以文心兰品种‘柠檬绿’（雄性不育）和‘巧克力’（可育）为试验材料,对花粉团和花粉粒的形态进行观察,并在转录组数据分析的基础上,利用RT PCR技术从‘柠檬绿’中克隆了1个MYB转录因子基因（OnMYB106）,用qRT PCR技术分析该基因的相对表达量,以初步鉴定‘柠檬绿’花粉败育特征,揭示花粉败育与OnMYB106基因的调控关系。结果显示：（1）‘柠檬绿’花粉团药室明显变扁,外壁凹陷、皱缩。（2）‘柠檬绿’花粉细胞内含物缺失,细胞质空泡化严重,花粉粒形态异常,花粉壁发育不连续,有许多孔洞（并非萌发孔）。（3）成功克隆获得‘柠檬绿’MYB106的基因序列,命名为OnMYB106,其开放阅读框为819 bp,编码272个氨基酸;其基因组序列与cDNA比对显示,OnMYB106基因含有3个外显子和2个内含子。（4）生物信息学分析表明,OnMYB106属于SANT 超家族,具有2个连续的MYB DNA binding结构域,是一个典型的R2R3 MYB转录因子;进化树分析表明,OnMYB106与高粱、水稻和二穗短柄草的MYB106蛋白序列的一致性最高,进化距离最近。（5）qRT PCR分析显示,OnMYB106在‘柠檬绿’花粉团中下调表达;该基因在‘柠檬绿’不同组织器官中均有表达,但在花中表达量最高,假鳞茎中表达量最低;在不同花期中,花苞期表达量最高,盛开期只有微量表达。研究认为,‘柠檬绿’花粉壁发育异常可能导致其花粉败育;OnMYB106基因可能在‘柠檬绿’花器官的生长发育中起重要的调控作用,并且该基因可能属于花粉发育“早期”表达基因,主要影响‘柠檬绿’花粉壁的的形成。     

苜蓿雄性不育系MS-4 SSH文库构建及基因表达分析

以苜蓿雄性不育系MS-4与可育系花蕾为材料,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,分别构建了不育条件下和可育条件下基因差异表达消减cDNA文库,在2个库中分别随机挑选阳性克隆进行测序,经序列比对分析,共获得功能已知的EST序列190条。后经GO功能分类,对推定出的6个相关基因进行荧光定量PCR分析。结果表明:6个基因在苜蓿雄性不育系花蕾不同发育时期中均出现差异表达,推测这6个基因可能与苜蓿雄性育性相关,并且在其育性转换中具有重要作用。     

Isolation and characterization of a male sterility gene homolog <Emphasis Type="Italic">BcMS2</Emphasis> from Chinese cabbagge-pak-choi that expressing in an anther-specific manner

A male sterility gene homolog, designated BcMS2, was isolated from flower buds using gene-specific primer pairs and was submitted to GenBank under accession number EF093533. Comparison of BcMS2 gene with MS2 from Arabidopsis thaliana and MS2Bnap from Brassica napus revealed some differences in gene structure and evolution. The full genomic DNA sequence of BcMS2 was 2,576 bp in length containing 8 exons and 7 introns, more than those of MS2Bnap but less than MS2. RT-PCR showed that BcMS2 gene expressed only in stage III flower buds of male fertile Chinese cabbage-pak-choi 'ZUBajh97-01B' and there were no detection in all organs of Polima cytoplasmic male sterility (CMS) line 'Bpol97-05A' and Ogura CMS line 'Bogu97-06A'. Furthermore, RT-PCR revealed that BcMS2 expressed only in anthers of male fertile material and there were no expression in sepals, petals, filaments and pistils. These results suggested that BcMS2 was an anther-specific gene and might be essential for the fertility of Chinese cabbage-pak-choi.     

重组PCR技术研究进展和应用

重组PCR是用聚合酶链反应体系来实现DNA重组的技术。经过二十多年的发展,该技术已形成三个各具特色的方法分支：重叠延伸拼接、跳跃PCR和DNA重排。近几年,以利用天然的差异基因作为重组来源为目的,通过简化操作步骤、提高捕获变异的效率、借助于表面展示技术和荧光探针技术搭建的高通量筛选平台,重组PCR技术在基础研究和工程应用研究的众多领域中的应用价值不断增加。     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

潮霉素B抗性为选择标记的整合型表达载体的构建及在米根霉中的遗传转化

为了建立适合米根霉的遗传转化体系,应用重叠延伸PCR的方法构建了以潮霉素B抗性为选择标记的单交换整合型表达载体p BS-hygro-ldh A;分别采用PEG/Ca Cl2介导的原生质体转化、原生质体电转化及萌发孢子电转化的方法将表达载体p BS-hygro-ldh A转化入米根霉AS 3.819菌株中,并研究了菌丝酶解时间、孢子萌发时间以及电转化电场强度对于转化效率的影响;通过荧光定量PCR(q PCR)对米根霉转化子基因组中质粒整合拷贝数进行了检测,并研究了其对米根霉转化子抗性稳定性的影响。实验结果表明成功获得整合了表达载体p BS-hygro-ldh A的米根霉转化子。菌丝酶解140 min产生的原生质体其再生率和转化率最高,原生质体电转化最佳电场强度为13 k V/cm,孢子萌发2.5 h转化率最高,萌发孢子电转化最佳电场强度为14 k V/cm。萌发孢子电转化方法转化率要高于原生质体转化的方法。荧光定量PCR检测结果表明,在一定范围内,高质粒整合拷贝数的米根霉转化子比较稳定。研究建立了用于工业米根霉菌株的遗传转化体系,为米根霉代谢调控研究以及菌种改造工作提供了基础与支持。     

PCR筛选BAC文库和直接BAC末端测序方法的建立

建立了一种用PCR方法筛选富含高度重复序列的大麦BAC DNA 文库和直接对 BAC DNA进行末端测序的方法.用PCR技术进行大麦BAC DNA 文库(含816个平板,每个平板含384个克隆)的筛选分4步进行.在实验中,建立了两个水平的BAC DNA池(一级池和二级池).一个二级池由一个平板(含有384个克隆)的DNA 组成,一个一级池由连续10个稀释100倍的二级池的DNA混合而成(如1～10,11～20等),共82个一级池.BAC DNA 文库筛选的第一步是对82个一级池的筛选.得到阳性一级池后(如2号一级池),对其所含的10个二级池(从11～20)进行第二步筛选.得到阳性二级池后,培养相应的阳性平板的所有克隆(384个),从头开始(左上侧),每相邻的4个克隆为一组,在96孔板上(4 X 96=384) 进行第三轮PCR反应;之后对筛选结果为阳性的4个克隆分别进行菌落 PCR(第四轮)得到单一阳性克隆.根据BAC DNA Hind III 酶切指纹图谱,对同一引物筛选的BACs进行重叠群作图(Contig).对代表contig 的两端的BAC DNA直接进行末端测序并对测序结果Blast,以检测其在大麦中是否属于单拷贝序列.根据测序和Blast结果设计引物,用中国春附加系(附加大麦染色体)对来自BAC克隆的引物进行染色体定位并用分离群体进行遗传学作图,以确定是否可以用作下一步的染色体步行.     

猕猴巨细胞病毒(RhCMV)nested PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立猴巨细胞(RhCMV)病毒的nested PCR检测方法,并初步应用。方法根据GenBank中报道的RhCMV全基因序列,针对其中的保守区域Rh85设计两对引物进行nested PCR反应,利用此方法对20份猕猴全血标本进行检测,将检测到的猕猴阳性标本扩增片段进行克隆测序。结果利用保守区域Rh85设计的引物可对人HCMV阳性对照进行扩增。用此方法检测的20份猕猴全血标本,出现2例阳性。其中一例扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的RhCMV序列基本相同。结论建立了从猴全血中直接检测猴RhCMV病毒DNA的敏感、特异的nested PCR方法。     

一株双歧杆菌质粒聚合酶基因的PCR扩增和鉴定

目的PCR扩增人双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因。方法用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,PCR扩增长双歧杆菌质粒聚合酶(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)基因,对BPP基因检测阳性的PCR产物通过序列分析,进行鉴定。结果人长双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因PCR扩增后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,测得BPP基因的相对分子质量约为1.9 kb。通过BLAST序列比对分析与GenBank中相应基因同源性为96%。结论成功克隆了1株双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因,为构建与双歧杆菌宿主质粒相适应的载体奠定了基础。     

Targeting polyketide synthase gene pool within actinomycetes: new degenerate primers

Natural products provide a unique element of molecular diversity and biological functionality and they are still indispensable for drug discovery. The polyketides, comprising a large and structurally diverse family of bioactive natural products, have been isolated from a group of mycelia-forming Gram-positive microorganisms, the actinomycetes. Relatively high amino acid sequence identity of the actinomycetes type I polyketide synthases (PKSs) was used to design three degenerate primer pairs for homology-based PCR detection of novel PKS genes, with particular interest into PKSs involved in biosynthesis of immunosuppressive-like metabolites. The stepdown PCR method, described here, enables fast insight into the PKS arsenal within actinomycetes. Designed primers and stepdown PCR were applied for the analysis of two natural isolates, Streptomyces sp. strains NP13 and MS405. Sequence analysis of chosen clones revealed the presence of two distinctive sequences in strain Streptomyces sp. NP13, but only one of these showed homology to PKS-related sequences. On analysing PCR amplicons derived from Streptomyces sp. strain MS405, three different PKS-related sequences were identified demonstrating a potential of designed primers to target PKS gene pool within single organism.     

A nested real-time PCR assay has an increased sensitivity suitable for detection of viruses in aerosol studies

Aims:  Influenza is commonly spread by infectious aerosols; however, detection of viruses in aerosols is not sensitive enough to confirm the characteristics of virus aerosols. The aim of this study was to develop an assay for respiratory viruses sufficiently sensitive to be used in epidemiological studies.
Method:  A two-step, nested real-time PCR assay was developed for MS2 bacteriophage, and for influenza A and B, parainfluenza 1 and human respiratory syncytial virus. Outer primer pairs were designed to nest each existing real-time PCR assay. The sensitivities of the nested real-time PCR assays were compared to those of existing real-time PCR assays. Both assays were applied in an aerosol study to compare their detection limits in air samples.
Conclusions:  The nested real-time PCR assays were found to be several logs more sensitive than the real-time PCR assays, with lower levels of virus detected at lower Ct values. The nested real-time PCR assay successfully detected MS2 in air samples, whereas the real-time assay did not.
Significance and Impact of the Study:  The sensitive assays for respiratory viruses will permit further research using air samples from naturally generated virus aerosols. This will inform current knowledge regarding the risks associated with the spread of viruses through aerosol transmission.     

猪FGL2基因cDNA末端序列检测及结构分析

检测猪FGL2基因cDNA末端序列并对该基因结构初步分析。α-32P dCTP放射性同位素标记cDNA探针筛选猪基因组DNA文库;cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)。以猪正常小肠及心脏组织提取新鲜总RNA,反转录后作为模板,设计基因特异性引物,采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR扩增;依据猪与人FGL2基因3′端已知同源序列设计PCR上游引物,以人FGL2基因3′末端序列设计下游引物,以猪基因组DNA为模板采用Advantage 2 聚合酶混合物进行PCR反应;PCR载体重组质粒DNA亚克隆扩增。同位素探针未能筛选到特异阳性克隆,RACE反应检测到特异性转录起始位置及第一个转录终止位置,但仍未检测到第二个转录终止位置。猪基因组DNA行PCR扩增成功检测到猪FGL2基因3′末端未知序列及第二个转录终止位置。