棉铃虫Ⅰ型几丁质酶的表达

昆虫几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御、生长因子等重要生理生长发育过程。在本研究中,从NCBI下载棉铃虫几丁质酶序列,并克隆验证正确,构建的系统发育树表明属于Ⅰ型几丁质酶。将不包含信号肽的开放阅读框序列(1 707 bp)与pET28a载体连接,转化至大肠杆菌transetta(DE3)中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaCHT。用镍柱子纯化融合蛋白,纯化获得的融合蛋白对胶体几丁质有降解活性,其酶活力为0.023μg/mL·s~(-1)。不同龄期的qPCR结果显示,该基因在棉铃幼虫的6个幼虫期以及预蛹蜕皮后均有表达,但HaCHTI在4龄和6龄幼虫阶段表达相对较高,而在1龄、2龄、3龄、5龄幼虫和预蛹表达量较低。这些结果表明,异源表达的棉铃虫的I型几丁质酶对胶体几丁质具有降解活性,可能对棉铃虫正常蜕皮有着重要的作用。     

棉铃虫Ⅰ型和Ⅶ型几丁质酶基因表达规律的比较分析

几丁质酶（chitinase, CHT）在昆虫生长发育过程中主要有降解围食膜、外骨骼、角质层以及肠道内层的几丁质成分,从而参与昆虫的蜕皮和细胞增殖的功能。在本研究中,分析比较棉铃虫I型和Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域及其时空表达特性,对的进一步功能研究提供重要的素材。首先利用生物信息学在线工具SMART对本课题组前期所获得的几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域进行分析;之后采用qRT-PCR方法研究棉铃虫6龄幼虫不同组织和幼虫不同龄期蜕皮前后的中肠中HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的时空表达特性。结果表明：对几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ结构域进行分析,发现HaCHTⅠ和HaCHTⅦ均具有信号肽序列、催化区域、连接区域,且HaCHTⅠ有一个几丁质结合结构域,而HaCHTⅦ则无;棉铃虫Helicoverpa armigera几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ在6龄幼虫不同组织部位的均有表达,其中HaCHTⅠ在各个部位的表达量没有显著的差异,而HaCHTⅦ在头壳和体壁中表达显著高于其它组织;几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ在棉铃虫幼虫蜕皮前后中肠的表达量变化较大,其中HaCHTⅠ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递减的趋势,在4、5、6龄初期时表达量则是先减后增的趋势,而HaCHTⅦ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递增的趋势,恰与同一时期HaCHTⅠ的表达量相反,在4、5、6龄初期时HaCHTⅦ的表达量呈递减的趋势。棉铃虫HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的结构域和时空表达都存在差异,据此我们测这些差异可能对其功能具有一定的影响。本结果为深入研究几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的功能奠定了基础。     

烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。     

低温几丁质酶基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达及酶学性质表征

【目的】通过构建假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)低温几丁质酶(chitinaseA,chi A;chitinase C,chi C)的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒(p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C)并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质具有明显的降解活性,且具有一定协同降解能力。【结论】首次实现假交替单胞菌来源的低温几丁质酶在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化、酶学性质及其降解产物分析,为其他低温几丁质酶的研究提供借鉴意义。     

杀鱼假交替单胞菌C923几丁质酶基因PpchiC的克隆表达与酶学性质

【背景】某些假交替单胞菌可分泌几丁质酶,在降解利用几丁质为水产动物提供营养、免疫、抗病等方面有着重要潜力。【目的】克隆杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)C923的一个几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组几丁质酶的酶学性质进行研究。【方法】从菌株C923测序的基因组中注释到一个几丁质酶家族基因PpchiC,设计引物克隆该基因后进行生物信息学分析;构建载体进行异源表达并从温度、时间与诱导剂浓度进行表达优化;对表达蛋白进行最适温度与pH等酶学性质研究,同时比较了重组菌破碎后上清与沉淀及纯化的酶蛋白对几丁质的降解效应。【结果】基因PpchiC长1350bp,编码450个氨基酸,PpchiC蛋白理论分子量为48.76kDa,等电点为4.78,不稳定系数为29.08。结构域分析发现该蛋白含有一个类型Ⅲ几丁质结合域和一个糖苷水解酶18家族(glycosyl hydrolase 18,GH18)的催化域;PpchiC蛋白含有GH18家族几丁质酶的保守催化基序DxxDxDxE、YxR和[E/D]xx[V/I]。16℃、0.25mmol/L IPTG、诱导12h为其最优化表达条件,PpchiC在50℃、pH8.0时表现出最大酶活性;以胶体几丁质为底物时,PpchiC的K_m值为2.58mg/mL、V_max值为5.04mg/(mL·min)。降解结果表明,菌体的沉淀与上清及从上清中纯化的酶蛋白均有着较好的几丁质降解效应。【结论】杀鱼假交替单胞菌C923基因PpchiC编码GH18家族的几丁质酶,能被大肠杆菌高效表达且降解几丁质效应明显,这为PpchiC及菌株C923的应用提供了参考依据。     

一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析

【目的】克隆耐冷菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)的几丁质酶基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其酶解产物。【方法】采用PCR扩增法从Pseudoalteromonas sp.DL-6中克隆几丁质酶基因(chi A),连接到表达载体p ET28a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测几丁质酶Chi A的分子量与纯度,4-甲基伞形酮荧光底物4MU-(Glc NAc)2测定酶活,电喷雾质谱(ESI-MS)检测酶解产物。【结果】chi A基因(Gen Bank登录号KF234015)在大肠杆菌中高效表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶Chi A的总活力可达168.68 U。ESI-MS检测结果表明重组蛋白酶解1%胶体几丁质的产物为几丁寡糖。【结论】利用内切几丁质酶Chi A水解几丁质生产几丁寡糖,为其在食品、医药和农业等领域的潜在应用提供有利参考。     

桑氏链霉菌几丁质酶ChiKJ40基因的克隆表达及其抑菌作用

【背景】目前关于桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)生防基因的研究不多,仅从其基因组中克隆了2个几丁质酶基因片段,其单个几丁质酶的完整基因序列相关研究未见报道。【目的】克隆S.sampsonii KJ40的几丁质酶基因Chi KJ40并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其抑菌作用。【方法】采用PCR扩增法从S.sampsonii KJ40中克隆几丁质酶基因Chi KJ40,连接到表达载体p ET-32a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。使用His标记蛋白质微量纯化试剂盒对重组几丁质酶进行纯化,Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的浓度,几丁质酶试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的几丁质酶活性。观察重组几丁质酶对桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、链格孢菌(Alternaria alternate)、紫丝核菌(Rhizoctonia violacea)几种致病真菌的抑菌作用。【结果】Chi KJ40基因(登录号为MF434484)在E.coli中经IPTG诱导表达,获得42 k D的重组几丁质酶,不同浓度IPTG在37°C诱导3 h,蛋白产量无明显变化。0.2 mmol/L IPTG 16°C诱导过夜,重组几丁质酶主要以可溶性形式存在于上清,小部分以包涵体存在于沉淀中。粗酶液几丁质酶活性为0.080 U/m L,酶比活力为0.041 U/mg,纯化酶液几丁质酶活性为0.046 U/m L,酶比活力为0.115 U/mg,纯化倍数为2.8,酶活回收率为57.5%。重组几丁质酶处理后,C.scoparium、C.parasitica和A.alternata菌丝细胞出现分节、膨胀,R.violacea菌丝溶解且部分被破坏成碎片。【结论】Chi KJ40基因的研究补充了S.sampsonii的生防背景,为几丁质酶基因找到了新的来源,并为其应用奠定了理论基础。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)表达及其生长发育的影响

【目的】几丁质酶和几丁质合成酶对昆虫的变态发育极其重要。本研究旨在阐明苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾Spodoptera litura几丁质酶和几丁质合成酶基因表达及其生长发育的影响。【方法】利用RT-qPCR检测斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)在斜纹夜蛾不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和4-6龄幼虫不同组织(体壁、中肠、脂肪体、血细胞、头部和马氏管)中的表达水平以及注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/头) 24, 48和72 h时斜纹夜蛾SlCht和SlCHS-A在6龄幼虫各组织中的表达水平。分析在斜纹夜蛾4龄幼虫中注射不同浓度(31.25, 62.5, 125, 250和500 ng/头)的苦瓜素Ⅰ溶液对幼虫和蛹历期、幼虫增重、蛹重、蛹长度、化蛹率、羽化率和存活率的影响,并利用体视显微镜观察斜纹夜蛾幼虫的表型变化。【结果】SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾中的表达具有发育阶段特异性。SlCht和SlCHS-A在卵期表达量最高,幼虫期和预蛹期的表达量较低;在各幼虫期又表现为6龄幼虫期表达量最高,在其他龄期的表达量低。SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾6龄幼虫中也显示出组织特异性表达,在血细胞和体壁中高表达,在头部、中肠和脂肪体中低表达。在斜纹夜蛾6龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ能诱导SlCht和SlCHS-A在其各组织中表达量降低;在4龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ后,斜纹夜蛾的生长发育受到抑制,幼虫增重延缓,发育历期延长,化蛹率下降甚至化蛹失败,幼虫及蛹出现较高的畸形率。【结论】苦瓜素Ⅰ可通过诱导SlCht和SlCHS-A表达量的降低来实现对斜纹夜蛾生长发育的抑制作用。本研究为进一步阐明苦瓜素对斜纹夜蛾生长发育的抑制机制提供了新的理论基础,并为进一步应用苦瓜素Ⅰ进行防控奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌MY75菌株几丁质酶基因的异源表达及特性

【目的】地衣芽孢杆菌MY75菌株的几丁质酶基因的异源表达,并对表达蛋白的特性进行研究。【方法】制备MY75菌株培养上清粗蛋白,利用酶谱分析确定具有几丁质酶活的蛋白分子量。将该蛋白进行飞行时间质谱分析,确定其部分氨基酸序列,设计PCR引物对MY75菌株的几丁质酶基因进行克隆及异源表达。对表达蛋白的最适反应温度及pH,温度耐受性及金属离子对酶活力的影响等特性进行了研究,并测定了表达蛋白对真菌孢子萌发的抑制活性和对甜菜夜蛾幼虫的杀虫增效作用。【结果】酶谱分析证明MY75菌株培养上清液中仅含有一种55kDa的几丁质酶。将该编码基因chiMY克隆及序列分析后发现,基因长度为1797bp,编码599个氨基酸。在大肠杆菌中异源表达的几丁质酶ChiMY蛋白的分子量为67kDa。质谱分析证明,55kDa蛋白与67kDa蛋白序列相同。ChiMY最适pH和最适温度分别为7.0和50°C,为中性几丁质酶。Li+,Na+,和Mg2+离子对表达蛋白的酶活力具有促进作用,Mn2+,Cr3+,Zn2+和Ag+离子则能显著抑制酶活力,Cu2+和Fe3+离子完全抑制酶活性。生物测定的结果显示,异源表达的MY75几丁质酶能够抑制小麦赤霉及黑曲霉的孢子萌发,并且对苏云金芽孢杆菌的杀虫活力具有增效作用。【结论】地衣芽孢杆菌MY75菌株中仅有一种55kDa几丁质酶,其编码基因能够在大肠杆菌中大量表达,表达蛋白分子量与野生型蛋白之间有显著差异,由此证明MY75菌株中存在着几丁质酶的剪切加工过程。明确了地衣芽孢杆菌几丁质酶ChiMY具有抑制真菌活性及杀虫增效作用。上述全部研究结论在国内首次报道。     

川西云杉几丁质酶基因PlCHI的克隆、表达与生物信息学分析

以川西云杉（Picea likiangensis var.balfouriana（Rehd.et Wils.）Hillier ex Slsvin）为材料,利用RT-PCR技术,克隆获得几丁质酶基因PlCHI的cDNA全长序列,并对该基因的序列特征及基因表达情况进行分析。结果显示,PlCHI的开放阅读框长1017 bp,共编码338个氨基酸;蛋白序列结构域分析结果表明,PlCHI为ClassⅠ类几丁质酶,属19家族,兼具溶菌酶活性;该序列与其他植物几丁质酶的蛋白序列相似性较高。系统发育分析结果显示,川西云杉PlCHI序列与北美云杉（Picea sitchensis（Bong.）Corr.）、黑松（Pinus thunbergii Parl.）等松科植物亲缘关系最近。进一步将PlCHI重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中,表达出约45 kD的蛋白,主要以包涵体形式存在,且在25℃下采用0.2 mmol/L的IPTG诱导4 h时蛋白的表达量最佳。     

水稻几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

将克隆并确定序列的水稻(Oryza sativa L．Cpslo17)几丁质酶基因Oschi的cDNA序列(此序列已在GenBank中注册, 登录号为EU045451)插入原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切、序列鉴定分析后, 用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3); 经IPTG诱导获得表达, 并对Oschi蛋白表达条件进行了优化; 在大肠杆菌中表达的几丁质酶经纯化后在一定的浓度、一定的反应时间内能高效地分解几丁质。     

水稻几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

将克隆并确定序列的水稻(Oryza sativa L．Cpslo17)几丁质酶基因Oschi的cDNA序列(此序列已在GenBank中注册, 登录号为EU045451)插入原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切、序列鉴定分析后, 用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3); 经IPTG诱导获得表达, 并对Oschi蛋白表达条件进行了优化; 在大肠杆菌中表达的几丁质酶经纯化后在一定的浓度、一定的反应时间内能高效地分解几丁质。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化

【目的】对转棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母工程菌GS-tachi1-K进行诱导表达,研究重组几丁质酶Tachi1的酶学性质,优化表达条件。【方法】对GS-tachi1-K进行甲醇诱导培养,纯化目的蛋白Tachi1进行几丁质酶酶学性质的研究;通过单因素和正交试验对GS-tachi1-K菌株产几丁质酶Tachi1表达条件进行优化。【结果】GS-tachi1-K表达的几丁质酶Tachi1表观分子量约为44 kDa,酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5,具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力,在碱性条件下稳定性较差;受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。该菌株的最佳表达条件为:pH为6.5,甲醇诱导浓度为0.5%,起始细胞浓度为OD600=2,甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL,蛋白表达量为6.19 g/L。【结论】成功实现了棘孢木霉新几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母高效分泌表达,工程菌GS-tachi1-K具有高表达量和表达产物酶活性高两个特点,明确了几丁质酶Tachi1的酶学性质和最佳诱导表达条件,为该几丁质酶及其基因的深入研究和开发利用奠定了基础。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2 基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质.方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性.用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究.结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性.该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2和Zn2+的强烈抑制.结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础.     

棉铃虫过氧化物酶基因HaPOD的克隆和表达分析

【目的】克隆棉铃虫Helicoverpa armigera过氧化物酶基因(HaPOD)并进行序列分析,研究HaPOD基因的时空表达模式以及在极端温度、双氧水处理和HaNPV感染后的基因表达变化模式。【方法】基于转录组测序获得HaPOD基因序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸和氨基酸序列进行分析。采用实时荧光定量PCR技术检测HaPOD基因在棉铃虫体内的时空表达模式及4种逆境处理后的表达变化情况。【结果】序列分析显示该基因开放阅读框长1 332 bp,编码443个氨基酸,含有一个细胞粘附蛋白序列,氨基酸序列与甜菜夜蛾Spodoptera exigua同源物序列一致性为85%,亲缘关系最近。HaPOD基因在5龄以前表达量相对较低,5龄后表达量开始升高,蛹第5天最高。在幼虫头和成虫翅中表达量相对较高。在高温、双氧水和HaNPV感染处理后,该基因表达量显著升高,而在低温处理后表达量显著下调。【结论】本研究克隆得到了棉铃虫HaPOD基因序列并对其进行了分析,其表达量在高温、双氧水和HaNPV感染处理后上调而低温处理后下调,这些结果为进一步研究过氧化物酶在维持氧化还原平衡和抵抗氧化损伤方面的功能奠定基础。     

莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】为揭示昆虫病原真菌分泌的几丁质酶对宿主感染致病时的作用,对莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因进行了克隆与表达,并检测了表达产物的活性。【方法】采用CTAB法提取菌体DNA,设计特异性引物,多次PCR扩增克隆莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全序列,并克隆基因的ORF片段chit1,与载体pPIC9K相连接,构建表达载体pPIC9K-Chit1,转入毕赤酵母感受态细胞中,然后通过1.5mg/L浓度的G418筛选及PCR验证,将阳性转化子进行诱导培养,对发酵液分别进行酶活性测定试验、几丁质酶透明圈验证试验和SDS-PAGE电泳检测。【结果】莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全长序列为2756bp(NCBI登录号:EU795711),PCR扩增得到开放阅读框ORF片段chit1为1827bp,其中包含3个内含子,5′端非编码区长76bp,3′端非编码区240bp,编码424个氨基酸的几丁质酶前体,理论信号肽剪切位点在Gly(20)与Leu(21)之间;毕赤酵母重组细胞发酵液中几丁质酶活性随着发酵时间的延长而增加,72h达到最大值482.5U/100μL,透明圈活性验证试验显示,在含1%的几丁质平板上可出现明显的透明圈,表达产物SDS-PAGE电泳检测其分子量为41.0kDa。【结论】本研究克隆到莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因,其ORF成功重组到毕赤酵母中并表达出有活性的几丁质酶。基因表达产物的利用对进一步研究病原真菌染病昆虫的机制等具有重要意义。     

嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus热稳定几丁质酶的克隆表达及活性研究

研究通过RT-PCR和Tail-PCR技术从嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus中克隆了一个几丁质酶同源基因。该基因全长1,253bp,包含一个由1,197个碱基构成的开放阅读框,编码398个氨基酸。序列比对分析表明,该基因编码蛋白属于糖苷水解酶18家族的几丁质酶。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化毕赤酵母。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,达到0.433g/L,酶活力为28.96U/mg,同时对表达的几丁质酶进行了纯化,SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为43.9kDa。该几丁质酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0,70℃处理30min仍有45%的相对酶活,具有较好的热稳定性及工业应用价值。     

暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;构建pET30a-HpUAP重组表达载体,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达;利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后,观察其生长发育和存活情况,并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP 全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基,蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白,与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高,组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢,体表颜色加深并皱缩;RNAi处理72 h后,与对照组（dsGFP注射组）相比,dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右,表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢,在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶基因的序列 ,设计引物 ,引入适当的酶切位点 ,利用PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段。将该基因片断克隆至原核表达载体 pProEXHTb ,经IPTG诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达 ,表达产物的大小为 6 0kD ,含量占菌体总蛋白量的 4 0 %。利用来源于AcMNPV几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测 ,获得特异性的显色信号 ,证实所获原核表达产物与杆状病毒的几丁质酶具有同源性