携带靶向性可调控自杀基因的重组相关腺病毒载体的构建及其活性检测

目的:构建携带受Tet-On以及VEGF启动子双调控自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体,研究其在乳腺癌细胞MCF-7中的可调控表达.方法:用PCR方法扩增VEGF启动予,将其插入pAAV/TRE/HSVtk/Tet-On中形成重组载体pAAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On质粒.进行病毒包装后得到了rAAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On重组腺相关病毒.用重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺HBL-100细胞,用MTT法及RT-PCR检测在Dox诱导下,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞和HBL-100细胞的杀伤作用以及HSVtk基因在MCF-7细胞内的表达情况.结果:在rAAV+Dox+GCV组,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞的杀伤作用明显高于rAAV+Dox组,rAAV+Dox组以及HBL-100组,并且RT-PCR结果显示经Dox诱导HSVtk表达较明显.结论:成功构建了携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体,该病毒载体能有效的感染乳腺癌细胞MCF-7,并能联合GCV治疗,抑制肿瘤细胞生长,而且具有靶向性.     

细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建细胞周期蛋白E（CyclinE）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中CyclinE表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒（命名为pGENESIL／CyclinE-1和pGENESIL／Cyclin E-2）进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果 CyclinEsiRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论 Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。     

Tet-On调控HSVtk表达的重组腺相关病毒载体的构建和感染活性的检测

构建含有Tet基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体pAAV TRE HSVtk Tet_On ,并使用PCR技术和限制性内切酶消化进行鉴定。用构建好的重组质粒分别与辅助质粒pAAV_RC、pHelper以磷酸钙共沉淀法转染HEK2 93细胞,进行病毒包装后得到了AAV TRE HSVtk Tet_On重组腺相关病毒,以氯化铯密度梯度离心对包装好的病毒进行纯化。用纯化后的重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF_7后,斑点杂交检测结果显示,HSVtk基因整合进入MCF_7细胞基因组中。有感染活性的重组腺相关病毒能将目的基因转移到宿主细胞中,在Dox诱导下,GCV对AAV感染的MCF_7细胞具有明显的杀伤作用。     

ω-6脂肪酸脱氢酶基因在乳腺癌细胞内的表达和作用

为探讨ω- 6脂肪酸脱氢酶基因fat -1在人类乳腺癌细胞MCF- 7中表达和对其生长的作用,将fat -1基因插入到腺病毒载体中,构建腺病毒重组载体(Ad·GFP·fat1) .通过包装细胞系(2 93)产生重组腺病毒,感染MCF 7细胞.用核糖核酸酶保护性分析技术,检测fat -1基因在MCF- 7细胞内的表达,细胞增殖试剂盒(MTT)和凋亡染色试剂盒染色分析fat 1基因对MCF- 7细胞增殖和凋亡的影响,用酶联免疫分析花生酸类(eicosanoids)前列腺素E2 (prostaglandinE2 )的含量.结果显示,腺病毒介导的fat- 1基因能在MCF- 7细胞内有效异源表达,抑制MCF -7细胞的增殖且导致凋亡,前列腺素的含量也明显地减少.结果说明,fat- 1基因在乳腺癌的基因治疗中具有良好利用价值.     

eIF-4E腺病毒载体构建及对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响

摘要 目的：构建乳腺癌真核细胞起始因子一4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF-4E)基因重组腺病毒载体,并观察其对乳腺癌细胞MCF-7转移能力的影响。方法：应用基因重组技术将eIF-4E基因构建于腺病毒载体pAD-X,转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒,并用real-time PCR进行eIF-4E基因表达的验证。将重组腺病毒pAD-eIF-4E感染MCF-7细胞后,应用transwell小室法观察其对细胞侵袭和运动能力的影响。结果：酶切结果与预期相符,real-time PCR可检测到转染后MCF-7细胞有eIF-4E基因表达。且病毒转染后transwell小室可见,MCF-7细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制（均为p<0.01）。结论：重组eIF-4E腺病毒载体正确构建,其对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和运动都有抑制作用。     

改变细胞膜的脂肪酸组成可促进乳腺癌细胞凋亡

目的: 研究n-6脂肪酸脱氢酶 fat-1基因在人乳腺癌细胞内的表达,改变细胞膜脂肪酸组成,对乳腺癌细胞的凋亡作用。方法: 构建含有fat-1 基因的重组腺病毒载体 (Ad.GFP.fat-1),通过包装细胞系（293）产生的腺病毒,感染人乳腺癌细胞MCF-7。提取细胞的总RNA,以fat-1的反义mRNA 作探针,用Northern Blot检测fat-1 基因在MCF-7细胞内的表达。MTT法分析fat-1 基因对MCF-7细胞增殖的影响,凋亡染色试剂盒检测细胞的凋亡。气相色谱仪分析对MCF-7细胞的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs含量影响。结果: 通过基因重组技术,得到预期的重组病毒;fat-1 基因在人乳腺癌细胞MCF-7 中能有效异源表达,2天后,可检测到fat-1 mRNA的条带。与对照细胞相比,fat-1基因有效地抑制了MCF-7细胞的增殖（23%,p<0.05）,促进了凋亡（增加35%）;同时降低了人乳腺癌细胞MCF-7细胞膜n-6 PUFAs/n-3 PUFAs的比率。结论: 腺病毒介导的fat-1 基因能在人乳腺癌细胞MCF-7内有效异源表达,且抑制了MCF-7细胞的增殖。机理为降低了细胞膜的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs的比率。     

多西他赛诱导乳腺癌MCF-7耐药细胞株的建立及耐药机制分析

目的:建立人乳腺癌MCF-7多西他赛(DTX)耐药细胞株,并对其耐药机制进行初步分析。方法:采用逐步提高多西他赛浓度、间歇诱导的方法,建立人乳腺癌MCF-7/DTX体外耐药细胞模型;耐药曲线检测MCF-7/DTX的耐药特性;流式细胞术比较耐药细胞株MCF-7/DTX及亲本细胞株MCF-7肿瘤干细胞含量的差异。结果:耐药曲线显示MCF-7/DTX比亲本细胞株MCF-7耐药;流式细胞分析显示MCF-7/DTX的细胞干细胞含量为2.59%,MCF-7细胞的干细胞含量为1.28%。结论:采用逐步提高浓度、间歇诱导的方法,建立了稳定、耐药性较高的MCF-7/DTX细胞株;干细胞含量升高是MCF-7/DTX的可能耐药机制之一。     

HAX-1抑制过氧化氢诱发的乳腺癌细胞MCF-7凋亡

目的：应用RNA干扰（RNAi）技术特异地干扰HAX-1在乳腺癌细胞MCF-7中的表达,研究其在过氧化氢诱导的细胞凋亡中的作用。方法：应用载体pSR-GFP／Neo构建针对HAX-1基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒;转染MCF-7细胞,G418筛选稳定细胞系,Western blot鉴定筛选的细胞克隆;用流式细胞仪检测筛选的细胞系在过氧化氢条件下的凋亡率。结果：电泳和测序证实合成的siRNA序列正确并准确克隆到pSR-GFP／Neo载体中;Western blot证实获得MCF-7／HAX-1 siRNA稳定细胞株,其HAX-1蛋白水平降低95％左右;用1mmol／L过氧化氢处理获得的稳定细胞株8h,细胞凋亡率明显高于对照组。结论：HAX-1能够保护乳腺癌细胞MCF-7免于过氧化氢诱导的细胞凋亡。     

动物活体成像生物发光稳定细胞株的构建

目的:构建组成型表达萤光素酶基因的载体,建立稳定高表达萤光素酶的MCF-7乳腺癌细胞株,检测其对细胞增殖的影响及在传代后的表达效果.方法:以载体pGIA.20为模板,PCR扩增萤火虫萤光素酶基因,将其克隆到载体pIRESpuro2上,将获得的pIRESpuro2-Luc经酶切和测序验证后,转染293T、MCF-7及ZR...     

慢病毒介导短发夹ShRNA 沉默ERβ 乳腺癌细胞株的建立

目的:利用慢病毒载体短发夹RNA(shRNA)介导人乳腺癌细胞ERβ基因沉默,筛选鉴定,并建立ERβ基因稳定下调的乳腺癌细胞株。方法:将靶向沉默ERβ基因的shRNA慢病毒颗粒感染人乳腺癌细胞株T47D和MCF-7,以未感染及空载体慢病毒感染的T47D和MCF-7细胞分别作为空白对照和阴性对照。先以慢病毒瞬转48 h,通过蛋白免疫印迹法(western-blot)进行蛋白水平检测筛选出干扰效果最好的两组,然后继续经浓度为1 mg/L的嘌呤霉素连续筛选4周,采用RT-PCR和western-blot方法,分别对ERβ在mRNA和蛋白水平上的沉默效果进行鉴定。结果:慢病毒感染乳腺癌细胞后,与阴性对照组相比,实验组ERβmRNA和蛋白表达量均明显下降(P〈0.05):其中T47D细胞株shRNA3326、3327两实验组下调效果最明显,ERβmRNA水平和蛋白水平分别达到(61.12±3.66)%、(76.47±3.16)%和(60.83±3.07)%、(53.31±3.00)%;MCF-7细胞株shRNA3325、3326两实验组下调效果最显著,ERβmRNA水平和蛋白水平下调率分别为(62.42±0.07)%、(42.49±1.96)%和(83.69±5.07)%、(73.16±13.21)%。而阴性对照与空白对照组相比无显著性差异,无统计学意义(P>0.05)。结论:成功筛选并建立了ERβ基因稳定下调的两株乳腺癌细胞系T47D和MCF-7,从而为后续探究改变ERβ表达水平在乳腺癌发生发展及在乳腺癌内分泌治疗效果中的作用提供有用的细胞研究模型。     

Mapping of the herpes simplex virus DNA sequences present in herpes simplex virus type-1 thymidine kinase-transformed cells

Analyses of the herpes simplex virus (HSV) DNA sequences which are present in three HSV thymidine kinase-transformed (HSVtk+) mouse cell lines have revealed that these cells contain relatively large and variable portions of the viral genome. Two of these cell lines do not contain the viral DNA sequences known to encode the early viral genes normally responsible for regulating tk gene expression during lytic HSV infections. This finding suggests that cell-associated viral tk gene expression may be regulated by cellular rather than viral control mechanisms. In addition, we have compared the viral DNA sequences present in one unstable HSVtk+ cell line to those present in tk- revertant and tk+ rerevertant cell lines sequentially derived from it. Our results have shown that within the limits of sensitivity of our mapping approach, these three related cell lines contain the same set of viral DNA sequences. Thus, gross changes in viral DNA content do not appear to be responsible for the different tk phenotypes of these cells.     

Fas/FasL-dependent and -independent activation of caspase-8 in doxorubicin-treated human breast cancer MCF-7 cells: ADAM10 down-regulation activates Fas/FasL signaling pathway

The contribution of Fas-mediated death pathway to doxorubicin-induced death of MCF-7 cells is not unambiguously elucidated. Thus, this study was conducted to explore doxorubicin-induced Fas/FasL signaling pathway activation in MCF-7 cells and doxorubicin-resistant MCF-7 (MCF-7/Dox) cells. Doxorubicin-induced caspase-8 activation was found to be mediated through Akt/ERK inactivation and FasL-independent Fas pathway in MCF-7 cells, while caspase-8 activation in MCF-7/Dox cells depended exclusively on FasL-stimulated Fas pathway. Suppression of caspase-8 activation restored the viability of doxorubicin-treated MCF-7 cells and MCF-7/Dox cells. Contrary to FasL surface expression exclusively detected in MCF-7/Dox cells, intracellular FasL expression was noted with MCF-7 cells. Promotion of FasL translocation to the cell surface by lysophosphatidic acid evoked a FasL-activated Fas death pathway in MCF-7 cells. Doxorubixin-evoked β-TrCP up-regulation promoted Sp1 degradation, which subsequently suppressed ADAM10 expression in MCF-7 and MCF-7/Dox cells. Doxorubicin-induced down-regulation of ADAM10 reduced FasL shedding, leading to Fas pathway activation in MCF-7/Dox cells. Knock-down of ADAM10 induced death in MCF-7/Dox cells, but marginally reduced the viability of MCF-7 cells. Taken together, our data indicate that Akt/ERK-mediated caspase-8 activation and Fas/FasL-mediated caspase-8 activation mostly elucidate doxorubicin-induced death in MCF-7 cells and MCF-7/Dox cells, respectively. These observations suggest a promising therapeutic modality for overcoming doxorubicin-resistant breast cancer by targeting ADAM10 sheddase activity.     

MiR-133a Is Functionally Involved in Doxorubicin-Resistance in Breast Cancer Cells MCF-7 via Its Regulation of the Expression of Uncoupling Protein 2

The development of novel targeted therapies holds promise for conquering chemotherapy resistance, which is one of the major hurdles in current breast cancer treatment. Previous studies indicate that mitochondria uncoupling protein 2 (UCP-2) is involved in the development of chemotherapy resistance in colon cancer and lung cancer cells. In the present study we found that lower level of miR133a is accompanied by increased expression of UCP-2 in Doxorubicin-resistant breast cancer cell cline MCF-7/Dox as compared with its parental cell line MCF-7. We postulated that miR133a might play a functional role in the development of Doxorubicin-resistant in breast cancer cells. In this study we showed that: 1) exogenous expression of miR133a in MCF-7/Dox cells can sensitize their reaction to the treatment of Doxorubicin, which is coincided with reduced expression of UCP-2; 2) knockdown of UCP-2 in MCF-7/Dox cells can also sensitize their reaction to the treatment of Doxorubicin; 3) intratumoral delivering of miR133a can restore Doxorubicin treatment response in Doxorubicin-resistant xenografts in vivo, which is concomitant with the decreased expression of UCP-2. These findings provided direct evidences that the miR133a/UCP-2 axis might play an essential role in the development of Doxorubicin-resistance in breast cancer cells, suggesting that the miR133a/UCP-2 signaling cohort could be served as a novel therapeutic target for the treatment of chemotherapy resistant in breast cancer.     

沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertionsite 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控.研究发现Bmi-1基因可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点.用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Bmi-1基因表达观察其对乳腺癌细胞株MCF-7侵袭和转移等生物学特性的影响,以探讨Bmi-1在乳腺癌发生发展中的作用.PT67细胞包装质粒后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株,稳定抑制Bmi-1的细胞株命名为MCF-7/Bmi-1si.通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达量;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力.MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,克隆形成数及形成率也明显减少(P<0.05).侵袭和转移实验表明:与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si组细胞在Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数明显减少(P<0.05).结果表明沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功,Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力.     

乳腺癌细胞株MCF-7-PC-1-46的建立

以人前列腺癌C4-2细胞基因组DNA为模板,扩增出PC-1基因N端编码46个氨基酸残基及其上游非编码区共599bp的DNA序列,将其正向克隆到真核表达载体pIRES2中,并在脂质体介导下,转染人乳腺癌细胞MCF-7,经G418筛选获得阳性单克隆,细胞扩大培养后,进行PCR和RT-PCR分析,检测外源PC-1基因在靶细胞中的整合与转录,PCR和RT-PCR结果表明,稳定转梁细胞株MCF-7-PC-1-46具有外源目的基因的整合和相应mRNA的高表达,说明成功建立了稳定表达外源PC-1基因N端46个氨基酸的人乳腺癌细胞株,为进一步研究PC-1基因的生物学功能提供了实验材料。     

Tet调控CYP2E1基因表达细胞系的代谢能力分析

应用Tet-On基因表达系统,调控CYP2E1基因在NIH 3T3细胞中的表达水平,探讨CYP2E1在化学致癌物二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)代谢中的作用．先后将 Tet-on基因表达系统的调控质粒pRevTet-on和反应质粒pRevTRE-2E1转染NIH 3T3细胞,分别用G418和潮霉素筛选,并通过RT-PCR和Western印迹检测,成功获得了3个具有良好诱导性Tet调控的CYP2E1基因表达细胞系（Tet/3T3-2E1）．应用不同浓度强力霉素(doxycycline, Dox)处理Tet/3T3-2E1细胞诱导CYP2E1表达,HPLC分析细胞对CYP2E1特异性药物探针氯唑沙腙的原位代谢能力及MTT法分析CYP2E1介导的NDMA细胞毒性作用．结果显示,Tet/3T3-2E1细胞CYP2E1的表达及其代谢能力有明显的Dox浓度依赖性,而且NDMA对Dox诱导组细胞有明显浓度依赖性细胞毒性作用,其IC₅₀值为12.06 μmol/L,无Dox诱导组未见明显的NDMA细胞毒性作用．该细胞模型的成功建立对于开展与CYP2E1相关的毒物、致癌物代谢研究,筛选抗毒物、抗癌物等具有重要价值．     

siRNA-cyclin D1对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用

研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对乳腺癌MCF-7细胞株cyclin D1表达的抑制及对细胞增殖的影响。化学合成针对cyclin D1基因的siRNA,转染MCF-7细胞株;分别应用荧光定量PCR和免疫印迹测定cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8测定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,软琼脂培养检测细胞克隆形成能力。在实验中,10、50、100 nmol/L siRNA-cyclin D1分别使MCF-7细胞cyclin D1 mRNA表达降低了57．85%、63．22%和68．02%,蛋白表达降低了51．13%、62．09%、77．68%。转染siRNA-cyclin D1后,细胞增殖受到抑制,细胞周期阻滞于G1期,软琼脂克隆形成率降低。结果提示siRNA可以有效抑制MCF-7细胞株中cyclin D1的表达,使细胞周期阻滞于G1期,从而抑制细胞增殖。     

高表达人核糖核酸酶抑制因子的乳腺癌细胞株的建立及其鉴定

目的建立稳定高表达人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的真核细胞系：乳腺癌细胞系,为进一步研究hRI抗肿瘤、抗氧化的作用机制奠定实验基础。方法将hRI通过逆转录病毒载体（pLNCX-hRI）经过病毒包装细胞（PA317）包装后的高滴度病毒上清,感染乳腺癌（MCF-7）细胞系,经G418筛选后,运用RT-PCR、Western blot等方法进行鉴定hRI在MCF-7中的高表达。结果hRI克隆到乳腺癌细胞（MCF-7）基因组,并随着基因组稳定高表达hRI。结论利用逆转录病毒载体感染真核细胞后获得高表达hRI的肿瘤细胞株,从而为进一步研究真核细胞内hRI的抗肿瘤作用机制提供条件。