受强力霉素调节的自杀基因表达载体系统的构建和在乳腺癌细胞株(MCF-7)的表达

自杀基因治疗是恶性肿瘤基因治疗中最常用的途径之一,以递转录病毒载体-pRevTRE为基础进行载体构建,首先使用PCR技术对单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSVtk)进行扩增,将HSVtk基因插入到pRe-vTRE,形成重组载体pRevTRE/HSVtk,用磷酸钙共沉淀法,经过两轮转染,分别将pRevTRE/HSVtk和pRevTet-On质粒导入乳腺癌细胞株（MCF-7）经过潮霉素B（HygromycinB)和G418筛选,建立了一株稳定的受四环素衍生物-强力霉素（Doxycycline,Dox)调控,表达HSVtk基因产物的人乳腺癌细胞株MCF/TRE/tk/Tet-On,HSVtk基因表达产物可以将无毒性的药物前体Ganciclovir(GCV)转变成一种有毒的代谢产物,从而杀死乳腺癌细胞株（MCF-7）,达到基因治疗的目的。     

Tet-On调控HSVtk表达的重组腺相关病毒载体的构建和感染活性的检测

构建含有Tet基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体pAAV TRE HSVtk Tet_On ,并使用PCR技术和限制性内切酶消化进行鉴定。用构建好的重组质粒分别与辅助质粒pAAV_RC、pHelper以磷酸钙共沉淀法转染HEK2 93细胞,进行病毒包装后得到了AAV TRE HSVtk Tet_On重组腺相关病毒,以氯化铯密度梯度离心对包装好的病毒进行纯化。用纯化后的重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF_7后,斑点杂交检测结果显示,HSVtk基因整合进入MCF_7细胞基因组中。有感染活性的重组腺相关病毒能将目的基因转移到宿主细胞中,在Dox诱导下,GCV对AAV感染的MCF_7细胞具有明显的杀伤作用。