同时表达麻疹病毒L4株HA和F蛋白及人白细胞介素2（IL2）的重组痘苗病…

构建了同时表达麻疹病毒Ｌ４株ＨＡ和Ｆ基因及人白细胞介素２（ＩＬ２）的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示,ＨＡ、Ｆ和人ＩＬ２基因均在痘苗病毒中稳定有效表达,且产物与天然蛋白相近,ＨＡ分子有糖化的７９ｋＤ和非糖化的６８ｋＤ两种形式．Ｆ分子以６０ｋＤ的前体Ｆ０,４３ｋＤ的Ｆ１和１８ｋＤ的Ｆ２三种式存在,表达产物的血凝效价为１：８,血溶活性ＯＤ５４０的测定结果是０．     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１－１６８株）病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的１．２ｋｂ片段,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的质粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达分子量为５４ｋＤ糖蛋白。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析了重组病毒ＤＮＡ中特异的ｇＤ基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

非复制型多价重组痘苗病毒粘膜与细胞免疫效果

对已构建的同时表达乙型肝炎病毒ＳＳ１、麻疹病毒ＨＡ和Ｆ以及ＩＬ２的非复制型重组痘苗病毒ＶＨＦＩＬ２△ＣＫＳＳ,及其相应的复制组病毒ＶＨＦＩＬ２ＳＳ１,进行了兔皮内毒力、粘膜免疫和细胞免疫效果的比较研究。发现ＶＨＦＩＬ２△ＣＫＳＳ在兔皮内的毒力明显低于ＶＨＦＩＬ２ＳＳ１。ＶＨＦＩＬ２△ＣＫＳＳ１经空肠内免疫家兔４周后,可在肠粘膜表面诱发特异性ＩｇＡ抗体,在血液中诱发特民性的ＩｇＧ抗体,其抗ＳＳ１和抗     

同时表达多种外源基因的非复制型重组痘苗病毒的构建

利用非复制型痘苗病毒载体,构建了能同时表达乙型肝炎（乙肝）病毒ＳＳ１、麻疹病毒ＨＡ和Ｆ及白细胞介素２（ＩＬ－２）的非复制型重组痘苗病毒ＶＩＨＩＬ２△ＣＫＳＳ１,及其相应的复制型重组豇轩病毒ＶＨＦＩＬ２ＳＳ１。这两株重组病毒在ＣＥＦ细胞上连续传至第２５代,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ,两株病毒均在Ａ２４、Ａ２７间稳定整合有ＳＳ１基因,非复制型重组病毒Ｃ、Ｋ间基因稳定缺失。经ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ     

表达HSV－2 gD基因的重组痘苗病毒保护小鼠对抗致死量HSV病霉攻击

利用ＰＣＲ方法对单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）基因进行了修饰,在其５＇端删去约５００ｂｐ的非编码区,仅保留ＡＴＧ上游７个ｂｐ。将修饰后的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入到带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的痘苗表达质粒ｐＪＳＡ１１７５,置于痘苗病毒Ｐ７．５ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ￣＋痘苗病毒天坛株感染的ＴＫ￣－１４３细胞,通过同源重组机制和标志基因ＬａｃＺ产物的蓝斑显色作用,以及ＢｕｄＲ试剂对ＴＫ表型的选择压力,筛选出整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交表明,ＨＳＶ－２ｇＤ基因已正确地插入痘苗病毒ＴＫ基因区内;间接免疫荧光检测显示,ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白已得到有效表达,且主要分布于细胞膜。重组病毒免疫家兔可产生明显的抗ＨＳＶ－２ｇＤ中和抗体。用重组病毒免疫小鼠,３周后可使９４％（１７／１８）的小鼠对抗ＨＳＶ－２的致死量攻击,表明重组病毒具有明显的免疫保护作用。     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒I型糖蛋白D的重组活疫苗…

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ｉ型病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ基因的１．２ｋｂ片估,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的持粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原供细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。     

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因变异的分析

从急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例分离的３２株脊髓灰质炎（脊灰）病毒,在ＶＰ１编码区,经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法鉴定,并经核酸测序进一步证实力疫苗株,其中５株为Ｉ型疫苗,１６株Ⅱ型疫苗株,１１株Ⅲ型疫苗株,以同样的分析方法检测这些毒株基因组的３Ｄ聚合酶编码区,发现２株Ｉ型疫苗株在３Ｄ区的４３１个核苷酸序列为野毒序列,即这２株Ｓａｂｉｎ１基因型（ＶＰ１）与野毒基因型（３Ｄ）重组株;其余３株Ｉ型疫苗株未发现基     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

UV—B辐射对小麦叶片H2O2代谢的影响

研究了温室种植的小麦在０（ＣＫ）、８．８２ｋＪ／ｍ＾２（Ｔ１）和１２．６ｋＪ／ｍ＾２（Ｔ２）三种剂量的紫外线Ｂ（ＵＶ－Ｂ）辐射下Ｈ２Ｏ２含量的变化及其机理。ＵＶ－Ｂ辐射下Ｈ２Ｏ２、还原型抗坏血酸（ＡｓＡ）和还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量增加,抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰｘ）和谷胱甘肽不原酶（ＧＲ）活性升高,脂肪酸不饱和度指数（ＩＵＦＡ）降低。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ谱图没有质上的差异,但凝胶着色深浅有变化。分析     

HIV—1长末端重复序列对重组痘苗病毒表达Gag蛋白的影响

将系列缺失的ＨＩＶ１长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘苗病毒载体中,经同源重组和血球吸附试验,成功地构建了６株重组痘苗病毒。免疫印迹和免疫酶试验检测均表明,６株重组病毒的Ｇａｇ蛋白表达量因ＬＴＲ不同而有明显差异,表明ＨＩＶ１的ＬＴＲ及其下游基因置于痘病毒启动子控制下,在痘苗病毒中表达时有下述特点：（１）不同的痘苗病毒启动子与全长ＬＴＲ相互作用,对ｇａｇ基因表达有显著不同的调控效果;（２）ＮＲ序列对Ｇａｇ蛋白表达没有明显影响;（３）ＥＮ序列不能被重组痘苗病毒表达系统识别;（４）ＴＡＲ序列可提高Ｇａｇ蛋白的表达量;（５）Ｕ５区及下游非翻译序列不影响Ｇａｇ蛋白的表达。     

麻疹病毒L4株血凝素基因的克隆与表达及免疫原性

从部分减毒的麻疹病毒Ｌ４株感染的Ｖｅｒｏ细胞中提取ｍＲＮＡ,进行逆转录及ＰＣＲ扩增,克隆到了长１．９ｋｂ的４个血凝素基因克隆,ＤＮＡ序列分析发现,Ｌ４株的血凝素甘因有４个碱基与Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株不一致。造成了３个氨基酸差异,这４个克隆在重组痘苗中的表达后,３个克隆的表达产物均表现出良好的血凝活性,助融合活性（Ｆｕｓｉｏｎｈｅｌｐｅｒ）和较强的免疫原性,表达血凝素分子量分别为未糖化的６８ｋＤ以及糖     

我国单纯疱疹病毒Ⅰ型168株糖蛋白D基因的克隆及其在痘苗病毒天坛株中的表达

将我国单纯疮疹病毒Ⅰ型１６８株基因组ＤＮＡ中扩增出的糖蛋白Ｄ基因,插入痘苗病毒ｐ７．５启动子下游,使其在痘苗病毒天坛株表达。免疫荧光分析表明,产生的重组病毒糖蛋白Ｄ能被运到被重组病毒感染的１４３细胞表面表达,表达的产物经Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ鉴定为分子量约５０ｋＤ的多肽。Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ证明重组病毒基因组中整合有ＨＳＶ－１１６８株糖蛋白基因片段,重组病毒免疫家兔后,产生了高滴度的ＨＳＶ特异性中和抗体。     

人白介素6受体基因在痘苗病毒载体系统中的表达

人ＩＬ－６受体是一个在各种细胞上广泛表达的跨膜糖蛋白分子,是ＩＬ－６发挥细胞效应所必需的。本文通过将ＩＬ－６ＲｃＤＮＡ重组到痘苗病毒的ＴＫ基因中构建成重组痘苗病毒ＶＩＬ６Ｒ。细胞原位杂交和ＡＰＡＡＰ染色结果表明,感染ＶＩＬ６Ｒ后的Ｖｅｒｏ细胞中,ＩＬ－６Ｒ在ｍＲＮＡ和蛋白水平上均呈现较强的表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析所表达的分子量为８０ｋＤ,表明所表达的产物是糖基化的。ＩＬ－６结合试验表明,表达的膜ＩＬ－６Ｒ能够结合ｒＩＬ－６,说明它是有功能的。利用ＶＩＬ６Ｒ免疫小鼠后,能够刺激较强的抗体产生。从而为进一步研究ＩＬ－６Ｒ的信号传导和构效关系提供了基础。     

痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

针对痘苗病毒天坛株非必需区ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ,构建了可去除ＴＡ２６Ｒ至ＴＡ３５Ｌ的１０个ＯＲＦｓ,并同时表达ＬａｃＺ的两步重组表达载体ｐＡ２４２７ＬａｃＺ。通过两种方法（一步重组和两步重组）获得了在该区域表达ＬａｃＺ基因的重组痘苗病毒ＲＶＡ２４２７Ｌdisplay status     

我国单纯疱疹病毒I型168株糖蛋白D基因的克隆及其在痘苗病毒天坛…

将我国单纯疱疹病毒Ｉ型１６８株基因组ＤＮＡ中扩增出的糖蛋白Ｄ基因,插入痘苗病毒ｐ７．５启动子下游,使其在痘苗病毒天坛株表达,免疫荧光分析表明,产生的重组病毒糖蛋白Ｄ能被运到被重且病毒感染的１４３细胞表面表达,表达的产物经Ｗｅｓｔｅｎｂｌｏｔ鉴定为分子量约５０ｋＤ的多肽,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明重组病毒基因组中整合有ＨＳＶ－１１６８株糖蛋白基因片段,重组病毒免疫家兔后,产生了高滴度的ＨＳＶ特异性     

人癌胚抗原-重组痘苗病毒的构建和制备

痘苗病毒的基因组庞大,结构复杂而特殊,不可能将外源基因直接插入它的基因组,必须利用一种特殊的痘苗病毒质粒,才能构建成功重组痘苗病毒．在分析了痘苗病毒质粒ｐＪ１２０〔含有我国天花疫苗－痘苗病毒天坛株７６１的启动子和胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,简称ＴＫ基因）,及含有人癌胚抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ,简称ＣＥＡ）ｃＤＮＡ全序列的质粒ｐ９１０２３Ｂ－ｃｅａ－１７结构的基础上,设计出三步法构建了重组疫苗病毒质粒ｐＪ－ＣＥＡ．经酶切及ＰＣＲ鉴定ｐＪ－ＣＥＡ中ＣＥＡｃＤ－ＮＡ的存在,进一步用同源重组方法构建了表达人ＣＥＡ的重组痘苗病毒,并以人体成纤维细胞作为宿主细胞,对ＣＥＡ－重组痘苗病毒进行了大量培养．再次证实痘苗病毒是良好的真核表达载体,可以高效而准确地表达细胞膜糖蛋白ＣＥＡ．     

IL—2重组杆状病毒载体的构建及表达

将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮ－ＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经限制性酶切和ＤＮＡ杂交筛选、鉴定出重组转移载体ｐＶＬ１３９２－ＩＬ２。重组载体通过在昆虫细胞内共转染将ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移到野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ中。经３２Ｐ标记探针鉴定出重组病毒Ａｃ１３９２－ＩＬ２。用重组病毒感染昆虫细胞,结果表达产物有明显刺激ＣＴＬＬ细胞生长,［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－２活性为１５００ＩＵ／ｍ１。     

柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达

将编码柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２的基因,分别克隆到具有７．５ｋ启动子的痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ５上;将ＣＶＢ３衣壳蛋白全基因克隆到具有Ｔ７启动子的痘苗表达载体ｐＴＭ１上,并筛先到相应的重组痘苗病毒ＶＶＰ１、ＶＶＰ２和ＶＶＰ／４／２／３／１。ＶＶＰ１和ＶＶＰ２稳定表达产物为ＣＶＢ３衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２,而ＶＶＰ４／２／３／１为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性     

6株A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1（1D）基因的核苷酸序列分析

早期收集保藏的６株Ａ型口蹄疫病毒（ＦＤＭＶ）（ＡＬ１－ＡＬ６）,适应ＢＨＫ２１单层细胞后,提取６株细胞增殖病毒的ＲＮＡ。用一对ＦＭＤＶ通用引物经反转录（ＲＴ）－ＰＣＲ法扩增了约５００ｂｐ的期望的ＤＮＡ片段。克隆目的的基因后,采用双脱氧ＤＮＡ链末端终止法测得了６株病毒的ＶＰ１基因２１０－６３９核苷酸序列。分析表明,３株病毒缺失３个核苷酸,从推导的氨基酸序列比较,确定缺失的３个核苷酸正好是一个密码子,