猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

实时荧光PCR结合融解曲线分析快速鉴定临床常见曲霉菌

目的 采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法快速将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平.方法 ①普通PCR扩增真菌ITS区后进行序列比对,准确鉴定菌种并设计种特异性引物和探针.②采用实时荧光PCR的方法及融解曲线分析,根据不同的解链温度将5种临床常见曲霉菌鉴定到种的水平.③特异性、敏感性、重复性试验.结果 ①解链曲线分析显示,不同种曲霉菌的种特异性探针有特异的Tm值,根据Tm值的不同可以将5种曲霉菌区分开来:烟曲霉Tm =61.4℃,黄曲霉Tm=57.4℃,黑曲霉Tm=67.7℃,土曲霉Tm=55.2℃和64.5℃,构巢曲霉Tm=65.8℃.其中小孢根霉和疣状瓶霉与烟曲霉探针发生交叉反应,阴性对照不出现特异性的解链曲线.②该方法对5种曲霉菌的检测下限分别为:烟曲霉56.8 fg,黄曲霉1 110fg,黑曲霉13.7 fg,土曲霉123 fg,构巢曲霉780 fg.③重复性试验结果显示,同一种曲霉菌的Tm值波动范围不超过0.5℃.结论 采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法可以快速准确地将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平,具有良好的敏感性、特异性和可重复性,有助于临床侵袭性曲霉感染的诊断和指导抗真菌药物使用.     

小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢SYBR Green I实时荧光定量PCR检测技术研究

由索氏平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana引起的小麦根腐病,常和其他土传真菌病害混合发生,传统的症状鉴别方法很难区分,导致病害防控难度增加。为建立病菌实时荧光定量检测体系,根据ITS序列设计引物,筛选出1对特异性引物BS‐F/R,扩增片段大小为280bp。以菌丝DNA为标准品构建实时荧光定量标准曲线,并对其灵敏度、特异性、可重复性进行评价。结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性好。构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,扩增效率良好。利用该定量检测体系,可以检测出田间小麦样品中52.8fg/μL的病菌DNA。     

实时荧光定量PCR方法检测小RNA

<正>Real-time QuantitativePCR Detecting System,即实时定量核酸扩增检测系统,也称为实时定量基因扩增检测系统,简称定量PCR(qPCR)。荧光定量PCR一般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR(以SYBR Green I为例)方法对小RNA进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小RNA的优点为:实验设计简单,一般需要一条特异性反转录引物,一条特异性正向PCR引物,反向PCR引物可通用于所有小RNA分析,无需象TaqMan方法那样专门设计探针;实验成本相对较低;可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术,而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下:     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

TaqMan-MGB探针检测文森巴尔通体博格霍夫亚种实时荧光定量PCR方法的建立及应用

【目的】应用TaqMan-MGB探针技术,建立具有种水平特异性、高敏感性的荧光定量PCR方法,用于快速检测文森巴尔通体博格霍夫亚种。【方法】在序列特异性扩增区标记(Sequence characterized amplifiedregion,SCAR)技术基础上,依据文森巴尔通体博格霍夫亚种一段特有的基因序列设计探针和引物,分别优化扩增反应的退火温度、探针和引物的反应浓度;分析此方法的特异性、敏感性及重复性;绘制标准曲线,评估PCR反应的扩增效率和稳定性。【结果】本研究设计的TaqMan-MGB探针具有种水平特异性;最低检出限为每个PCR反应11个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.12%-0.70%和0.14%-0.55%,在允许范围内;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率高(E=104.7%)。【结论】本研究建立的基于TaqMan-MGB探针技术的荧光定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出文森巴尔通体博格霍夫亚种,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

猪IGF-Ⅰ基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的:建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。方法:根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。结果:由pMD-18T IGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102~1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠。结论:成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的：建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法：研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法。用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果：结果表明该检测方法的特异性为100％,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×10^1-1×10^6拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×10^2CFU／ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5％。结论：本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的:建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法:研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法,用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果:结果表明该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101-1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102CFU/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5%。结论:本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备

目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米金,银增强实现可视化;进行特异性、灵敏性及重复性试验。结果:探针特异地与相应的标记目的基因片段杂交,并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号;2号探针能特异性检出JEV,3、4号探针可分别对Ⅰ型和Ⅲ型JEV进行分型;芯片对JEV质粒检测的灵敏度达105拷贝/mL;以蓝耳病病毒等5种病毒为对照,芯片只对JEV响应,具有特异性;制备的基因芯片具有批间、批内重复性。结论:制备的基因芯片具有高特异性、灵敏性及重复性,可以快速、准确、高通量地对JEV进行可视化分型检测。     

应用TaqMan荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的：利用Roche LightCycler实时定量PCR系统建立一种快速、灵敏、特异的检测土拉弗朗西斯菌的方法。方法：基于TaqMan荧光探针实时定量PCR技术,选择土拉弗朗西斯菌染色体上的特异序列[醇醛酮还原酶（AKR）和外膜蛋白FopA基因]作为检测靶序列,建立土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法;评价该检测方法的特异性和灵敏性;采用克隆菌株污染环境土壤来模拟实际样品,评价该检测方法在快速检测与现场检测等实际应用中的表现。结果：优化筛选基因组中的FT-AKR和FT-fopA片段作为检测靶序列,所建立的土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法检测克隆菌株质粒的灵敏度均为10个拷贝/每个反应体系;以其他非土拉弗朗西斯菌为模板未出现非特异扩增;模拟环境土壤样品检测灵敏度2个引物对分别为440和960CFU/g土壤;盲测实验结果显示对于灵敏度范围内的阳性样本均能正确识别,并能正确检测出不同浓度的阳性样本。以FT-fopA片段为靶序列的扩增效率不及基于FT-AKR引物对的扩增。结论：基于FT-AKR片段的引物对扩增效率高,检测土拉弗朗西斯菌具有特异、灵敏的特点,对临床诊断、环境污染监测、防治生物突发事件等具有重要意义。     

实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较

常规PCR及RT-PCR已用于对虾DNA及RNA病毒检测,但存在费时、灵敏度较低、不能定量等问题。建立了TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR方法,分别用于检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)4种对虾病毒。与常规PCR及RT-PCR比较,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR检测上述4种对虾病毒不仅有很高的特异性,检测灵敏度也提高了10～100倍,同时还具有快速、简便、不污染环境、重复性好、实时定量等优点,可明显提高对虾病毒检验检疫工作质量及效率。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA

目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法。方法：利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5＇端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价。最后收集15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果：试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250copies/mL。在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。结论：核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用。     

长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。方法根据已发表的小鼠肝炎病毒（MHV）S基因序列,设计合成引物。提取MHV细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、稳定性、重复性试验。并对65只长爪沙鼠及12只小鼠进行检测。结果建立的MHVRT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以MHVRNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为3．1pg／μL,可检测病毒最小滴度为10^-3／mL。65只沙鼠经RT-PCR检测,均为阴性,12只小鼠经RT．PCR检测,有3只MHV阳性,测序结果与Genbank中MHV核酸序列同源性均为97％。结论建立的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。     

金黄色葡萄球菌反向线性杂交探针检测方法的建立

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌的简单、快速、灵敏、准确的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因,设计一对通用引物及两条特异性探针,用生物素标记通用引物的5＇端,将两条特异性探针固定于硝酸纤维膜上,使PCR产物与探针杂交。结果建立的反向线性杂交探针方法,其检测限为2 ng/μL,检测特异性和准确性均为100%。结论建立的反向线性杂交检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

产肠毒素大肠杆菌快速检测方法的建立和评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的快速、便捷、敏感、特异的检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行评价,为实验动物检测和细菌性腹泻的诊断提供技术支持。方法根据GenBank公布的产肠毒素大肠杆菌的LT毒素基因序列(S60731.1)设计外引物和内引物进行LAMP扩增,对LAMP特异性和敏感性与PCR方法做比较。结果建立的LAMP方法检测最低浓度为100 pg/μL,灵敏度是PCR的10倍以上并具有较高的特异性,利用该方法对27份猴腹泻样品进行LAMP和PCR方法检测,发现PCR检出率为33.3%,LAMP(60 min内)结果与PCR相同,而LAMP(90 min内)检出率为92.6%,约是PCR检出率的3倍。结论建立了一种用于检测肠毒性大肠杆菌(ETEC)的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,适合于ETEC临床快速检测。     

Phylogenetic analysis of ten black yeast species using nuclear small subunit rRNA gene sequences

The nuclear small subunit rRNA genes of authentic strains of the black yeastsExophiala dermatitidis, Wangiella dermatitidis, Sarcinomyces phaeomuriformis, Capronia mansonii, Nadsoniella nigra var.hesuelica, Phaeoannellomyces elegans, Phaeococcomyces exophialae, Exophiala jeanselmei var.jeanselmei andE. castellanii were amplified by PCR and directly sequenced. A putative secondary structure of the nuclear small subunit rRNA ofExophiala dermatitidis was predicted from the sequence data. Alignment with corresponding sequences fromNeurospora crassa andAureobasidium pullulans was performed and a phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method. The obtained topology of the tree was confirmed by bootstrap analysis. Based upon this analysis all fungi studied formed a well-supported monophyletic group clustering as a sister group to one group of the Plectomycetes (Trichocomaceae and Onygenales). The analysis confirmed the close relationship postulated betweenExophiala dermatitidis, Wangiella dermatitidis andSarcinomyces phaeomuriformis. This monophyletic clade also contains the teleomorph speciesCapronia mansonii thus confirming the concept of a teleomorph connection of the genusExophiala to a member of the Herpotrichiellaceae. However,Exophiala castellanii did not belong to this clade. Therefore, this species is not the anamorph ofCapronia mansonii as it was postulated.