小鼠ameloblastin基因重组慢性病毒表达载体的构建及表达

目的：构建表达小鼠ameloblastin基因的慢性病毒表达载体,生产有感染及表达能力的病毒,为进一步研究ameloblastin基因在牙釉质形成中的功能奠定基础。方法：利用RT．PCR的方法从出生后1d钟状期小鼠牙胚组织totalRNA中扩增ameloblastin编码区cDNA,并克隆到pCRII-TOPO载体中,再亚克隆到pNL-IRES2-EGFP中。将病毒三质粒系统转染293T细胞,收集病毒,并鉴定病毒感染及表达能力。结果：通过酶切和PCR的方法鉴定ameloblastin基因已成功的构建入慢性病毒表达载体pNL-IRES2-EGFP中,经293T细胞生产的病毒感染人牙髓干细胞（DPSCs）,DPSCs有较强荧光发出,并可稳定表达ameloblastin基因。结论：成功的构建了慢性病毒表达载体,并获得有感染及表达能力的病毒。     

一株产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌的分离和鉴定

从天津塘活盐碱土壤中分离一株产碱性蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌HAP,并对其进行了表型分类和16S rDNA序列分析.结果表明,HAP是一株革兰氏阳性芽孢杆菌,菌体大小(0.7-0.9)μm×(2-3)μm,该菌可利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇,发酵型糖代谢产酸;可以水解酪素、淀粉,但不能水解酪氨酸;能够利用柠檬酸盐;其酶活力为1.22×104U/mL.结合系统发育学分析将HAP鉴定为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus).     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

基于三代测序的大秃马勃的rDNA ITS鉴定及其基因组生物信息学分析

【背景】马勃是著名的传统可食用药用真菌,具有多种药理作用,包括抗菌、抗炎、止咳、抗肿瘤和抑制细胞增殖等。目前关于马勃的研究多集中在活性物质的分离提取及其药理药效上,而对马勃基因组遗传信息知之甚少。【目的】获得马勃真菌的基因组遗传信息,挖掘潜在具有工业应用价值的功能基因。【方法】联合使用Illumina二代测序技术和PacBio三代测序技术进行基因组测序,并综合使用多种数据库进行基因组结构分析和基因注释,包括GO注释。基于基因组信息,使用rDNAITS序列进行马勃真菌物种鉴定,并使用dbCAN和antiSMASH进行碳水化合物活性酶和次级代谢物基因簇的鉴定。【结果】测序获得大小为46.04 Mb基因组,有11 903个蛋白编码基因,包括6 634个GO注释基因。基于基因组中的rDNA ITS序列信息将该菌鉴定为大秃马勃(Calvatia gigantea),分析了麦角甾醇和萜类合成相关基因25个,鉴定出317个碳水化合物酶和18个次级代谢物生物合成基因簇,并发掘出1个潜在的、可分泌的抗丹宁α-淀粉酶。【结论】获得一株马勃真菌基因组,并发掘出潜在的食品工业应用价值的抗丹宁α-淀粉酶和多个新的次级代谢物合成基因簇。这将为马勃真菌遗传进化、功能基因组学研究,以及其在食品工业应用和次级代谢物的药用价值开发提供重要的遗传信息基础。     

光照和pH对血红密孔菌生长及抗氧化活性的影响

探究不同光照和pH对药用真菌血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)生长及抗氧化活性的影响。分别设置了3个不同光照条件组(14 d光照、光照黑暗交替和黑暗)和4个pH组(pH 3、5、7和9),并在菌种培养的第2、4、6、8、10、12和14天测定其生物量、DPPH自由基清除率和总抗氧化能力(T-AOC)。血红密孔菌在14 d黑暗环境中有最大生物量和最强T-AOC活性。14 d黑暗条件下更利于血红密孔菌的生长,其生物量于第10～14天大量增加,并于第14天达到最高值,为4.49 g/L,生物量高出光照及更替条件近1.5倍。T-AOC活性在第12天最高,为25.10 U/mL。14 d黑暗培养环境下DPPH自由基的清除率也较高。不同pH条件对血红密孔菌培养过程中各项指标影响不同。当pH为5时血红密孔菌生长过程中产生的生物量于第10天最高,为7.12 g/L。而DPPH自由基清除率和T-AOC则在pH 7时第10天最高,分别为94.99%和64.34 U/mL;pH 7时次之。说明偏酸环境更能适宜血红密孔菌的生长,而中性及偏碱环境则有利于提高该菌的抗氧化能力。     

大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达

目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。