基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞的制备及其在丙谷二肽制备中的应用

来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)中的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase, SAET),是目前发现的丙谷二肽催化合成能力最高的酶之一,能够以非保护的L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺[即丙谷二肽(L-alanyl-L-glutamine, Ala-Gln)]。为了解决其在催化过程中的稳定问题,本研究在水相体系中采用“一步法”快速制备固定化细胞(SAET@ZIF-8),在构筑金属有机沸石咪唑骨架结构(ZIF-8)的同时,将表达有SAET的大肠杆菌(Escherichia coli)包裹在其内部空间中。在此基础上,对其结构、催化活性和重复使用性及储存稳定性等催化性能进行探究。结果表明,通过该方法制备的SAET@ZIF-8纳米颗粒与文献报道的ZIF-8材料的形貌基本相同,细胞的引入没有明显改变ZIF-8的形貌。重复使用7次后,SAET@ZIF-8仍能保持67%左右的初始酶活;室温下放置4d时,固定化酶还保留有50%左右的初始酶活,表明SAET@ZIF-8具有较好的重...     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

生物法合成辛伐他汀

通过提高E.coli BL21(DE3)/pAW31菌株中的酰基转移酶LovD的表达,并以Monacolin J为底物,催化合成辛伐他汀。考察发酵培养基和发酵条件对酰基转移酶LovD表达的影响;采用SDS-PAGE凝胶电泳法检测酰基转移酶LovD表达情况;并建立酶活测定方法,测定酰基转移酶LovD的实际酶活。通过实验确定酰基转移酶LovD摇瓶发酵的最佳条件:发酵培养基为TB培养基,接种量为4%,诱导初始菌密度为0.7(OD600)I,PTG浓度为0.2 mmol/L,在20℃下诱导20 h。在最佳条件下,酰基转移酶LovD的表达水平为100 mg/L,辛伐他汀的产量为1.2 g/L。     

谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。     

γ-谷氨酰转肽酶补料法合成L-茶氨酸工艺研究

对γ-谷氨酰转肽酶酶法制备L-茶氨酸的工艺进行优化。通过恒速补料的策略,以200 mmol/L L-谷氨酰胺和2 mol/L乙胺盐酸盐作为初始底物,37℃、p H10.0条件下反应,每2 h补加100 mmol L-谷氨酰胺,反应14 h,最终L-谷氨酰胺底物总浓度为900 mmol/L,L-茶氨酸的生成量达到573.2 mmol/L,转化率达到63.7%,生产强度为40.9 mmol/(h·L)。采用变速流加的工艺,以同样的初始条件进行反应,每2 h补加L-谷氨酰胺至初始浓度200 mmol/L,反应15 h,最终L-谷氨酰胺总浓度为600 mmol/L,L-茶氨酸的生成量达到445.8 mmol/L,转化率为74.3%,生产强度为29.7 mmol/(h·L)。     

双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅲ.丝腺体L-天门冬氨酸及α-酮戊二酸形成丙氢酸之机制

研究了家蚕(Bombyx mori L.),天蚕蛾科之蓖麻蚕(Philosama cynthia ricini B.)及柞蚕(Antheraea pernyi G.)丝腺体后部自L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成丙氨酸的机制。以上各种蚕的丝腺体组织都可利用L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成丙氨酸,谷氨酸及CO_2。当存在DL-环丝氨酸(10~(-4)M)时,形成较多的谷氨酸与丙酮酸,而丙氨酸之量显著地减少。以L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸或以L-谷氨酸与丙酮酸为底物,对丙氨酸之形成具有相同的抑制程度。DL-环丝氨酸(10~(-4))并不抑制谷-天转氨酶与草酰乙酸脱羧酶,但在同样条件下,可显著抑制谷-丙转氨酶的活力(～90%)。此外,若以L-天门冬氨酸或其与小量α-酮戊二酸为底物,尤其是用透析后之酶液,并无显著的丙氨酸与CO_2形成。我们认为,自L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成之丙氨酸,并非通过Bheemeswar提出的L-天门冬氨酸β-脱羧酶之作用,而是经过三个相继的反应,即在谷-天转氨酶催化下,形成谷氨酸与草酰乙酸,后者除非酶促分解外,在草酰乙酸脱羧酶作用下,形成丙酮酸与CO_2;由以上两反应所形成之谷氨酸与丙酮酸,在蚕丝腺普遍存在的谷-丙转氨酶催化下形成丙氨酸(见图8)。     

重组a-氨基酸酯水解酶合成头孢曲嗪

为了探索酶法合成头孢曲嗪的产业化工艺路线,从红纹黄单胞菌Xanthomonas rubrillineans中克隆-氨基酸酯水解酶基因全序列,转化入大肠杆菌中表达。以头孢曲嗪的合成转化率为指标,分别考察纯化的重组-氨基酸酯水解酶合成头孢曲嗪的最适温度、最适pH和最佳底物摩尔比。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,重组-氨基酸酯水解酶的单体分子量为70 kDa。催化合成头孢曲嗪的最适pH为(6.0±0.1),最适温度为36℃。底物浓度约为7-ATTC 30 mmol/L、HPGM HCl 120 mmol/L,酶用量22 U/mL时,头孢曲嗪的转化率达到64.3%。结果为优化酶法合成头孢曲嗪的产业化工艺奠定了基础。     

耐热嗜酸古细菌Sulfolobus acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的表达调控和性质研究

古细菌Sulfolobus acidocaldarius细胞内谷氨酰胺合成酶的表达量随着培养条件的改变有较大差异,RNA印迹表明,该差异是在mRNA水平受到调控.经DEAE-Sepharose和Sephacryl S-300两步分离酶蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶过滤测定分子质量,表明该酶为12个相同亚基组成,分子质量为630 ku的多聚体.该酶的最佳pH为7.3;对羟胺、谷氨酰胺、ADP和Mn2+的Km值分别为3.5 mmol/L、1.3 mmol/L、0.15 mmol/L和0.24 mmol/L;其γ-谷氨酰转移酶活性和生物合成酶活性的最佳温度均为90℃.Arrhenius曲线表明,γ-谷氨酰转移酶的活化能为47 kJ/(mol*K),生物合成酶的活化能分别为29 kJ/(mol*K)(40～75℃)和10 kJ/(mol*K)(55～90℃).对该酶的抑制剂研究发现,与其他来源的谷氨酰胺合成酶不同,甘氨酸、L-丙氨酸能明显抑制 S.acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的活性,而常规的抑制剂如L-色氨酸、L-组氨酸、5′-AMP却没有抑制作用,甘氨酸、L-丙氨酸的抑制作用为竞争性抑制,推断该酶的活性调节与绝大多数革兰氏阳性菌一样不受腺甘酰化的影响.     

利用巨大芽孢杆菌酶系合成L-丙氨酸和L-缬氨酸

本文研究了利用巨大芽孢杆菌ATCC_(39118)酶系合成氨基酸,同时也研究了丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶的提纯工艺。所获得的AlaDH、ValDHc和GlcDH的比活性分别为11.2u/mg,7.8u/mg和23.0u/mg。为了进一步探讨由α-酮酸酶法转化成氨基酸的最适条件,我们对以上三种酶的主要性质,包括稳定性,最适pH、动力学常数、底物专一性及底物和产物对酶的抑制作用等进行了测定。同时用粗酶提取液和纯酶进行了由丙酮酸合成L-丙氨酸,由α-酮异戍酸合成L-缬氨酸的批量实验,在转化中葡萄糖脱氢酶作为NADH的再生酶。结果粗酶提取液催化L-丙氨酸产量的克分子转化率为80％,而纯酶催化的克分子转化率增加到92％。L-缬氨酸产量的克分子转化率也类似(93％)。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

氨甲酰磷酸不同合成途径在大肠杆菌中的比较

【背景】氨甲酰磷酸是生物合成代谢中精氨酸与嘧啶的重要前体物质,在工业微生物生产精氨酸与嘧啶及其衍生物中发挥关键作用。【目的】在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中比较氨甲酰磷酸不同合成途径的催化效率。【方法】在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中过表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的基础上,分别过表达大肠杆菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPSⅡ)并表征其反应效果。通过优化底物供应(调整底物浓度与引入L-谷氨酰胺合成酶)对CK与CPSⅡ的催化反应进行优化。【结果】在大肠杆菌中过表达OTC,建立细胞水平氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上比较不同来源的CK,发现大肠杆菌来源的CK效果最好,50mmol/LNH4HCO3条件下全细胞催化9h得到2.95±0.15mmol/LL-瓜氨酸;过表达CPSⅡ时,50mmol/LL-谷氨酰胺催化9h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通过改变底物NH4HCO3浓度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式对CK与CPSⅡ的催化反应分别进行优化后,100 mmol/L NH4HCO3条件下,L-瓜氨酸浓度分别提高至4.67±0.55mmol/L和6.12±0.38mmol/L,且过表达GS后CPSⅡ途径可以利用NH3,不需要额外添加L-谷氨酰胺。【结论】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPSⅡ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,为精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一种更加高效的策略。     

耐热嗜酸古细菌Sulfolobus acidocaldarius 谷氨酰胺合成酶的表达调控和性质研究

古细菌Sulfolobus acidocaldarius细胞内谷氨酰胺合成酶的表达量随着培养条件的改变有较大差异,RNA印迹表明,该差异是在mRNA水平受到调控.经DEAE-Sepharose和Sephacryl S-300两步分离酶蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶过滤测定分子质量,表明该酶为12个相同亚基组成,分子质量为630 ku的多聚体.该酶的最佳pH为7.3;对羟胺、谷氨酰胺、ADP和Mn²⁺的K_m值分别为3.5 mmol/L、1.3 mmol/L、0.15 mmol/L和0.24 mmol/L;其γ-谷氨酰转移酶活性和生物合成酶活性的最佳温度均为90℃.Arrhenius曲线表明,γ-谷氨酰转移酶的活化能为47 kJ/(mol·K),生物合成酶的活化能分别为29 kJ/(mol·K)（40～75℃）和10 kJ/(mol·K)（55～90℃）.对该酶的抑制剂研究发现,与其他来源的谷氨酰胺合成酶不同,甘氨酸、L-丙氨酸能明显抑制 S.acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的活性,而常规的抑制剂如L-色氨酸、L-组氨酸、5′-AMP却没有抑制作用,甘氨酸、L-丙氨酸的抑制作用为竞争性抑制,推断该酶的活性调节与绝大多数革兰氏阳性菌一样不受腺甘酰化的影响.     

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质

【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。     

阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

[背景]阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A (coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成"a"系列或"b"系列的阿维菌素。[目的]探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造。[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性。[结果]AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min^-1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min^-1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min)。选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M。按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q149L/L121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min^-1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min)。[结论]研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据。     

脂肪酶YCJ01拆分对位取代α-苯乙醇

利用脂肪酶YCJ01催化拆分对位取代α-苯乙醇衍生物。以异丙醚为反应介质,采用乙酸乙烯酯作为酰基供体,对180 mmol/L的1-(4-甲基苯基)乙醇进行选择性酯化,脂肪酶粗酶粉添加量为5 g/L,50℃反应21 h后,底物转化率可达49.96%,对映体过量值e.e.s、e.e.p值分别为97.1%和97.2%,对映体选择性E200;同样,对1-(4-甲氧基苯基)乙醇进行选择性酯化,酰基供体为丁酸乙烯酯,底物浓度150 mmol/L,脂肪酶粗酶粉添加量为2.5g/L,30℃反应12 h后,底物转化率为49.8%,e.e.s、e.e.p值分别为97.7%和98.4%,对映体选择性E200,显示了很好的手性拆分效果。     

腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究

分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的编码基因(treP), 该酶可催化以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分解反应. 反向mRNA点杂交实验表明, 腾冲嗜热杆菌中treP基因在高盐胁迫条件下表达量增加, 而在海藻糖诱导条件下表达量降低. 将该基因导入不含TreP的大肠杆菌中进行诱导表达, SDS-PAGE表明, 异源表达的TreP分子量约为90 kD, 与预期值相同. 通过葡萄糖氧化酶法测定分解产物葡萄糖的产率表明: TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70℃, 最适pH值为7.0; 通过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明: TreP催化合成反应的最适温度为70℃, 最适pH值为6.0. 在最适反应条件下, 50 μg的TreP粗酶可催化25 mmol/L α-1-磷酸葡萄糖与葡萄糖在30 min合成11.6 mmol/L海藻糖; 而同量的酶在同样时间内仅能将250 mmol/L海藻糖分解生成1.5 mmol/L葡萄糖. 以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催化海藻糖的合成反应. 热稳定性实验表明, 该酶性质比较稳定, 在50℃下温育7 h还能保持77%以上的活性, 是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶.     

利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸

【目的】构建Bacillus subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶蛋白(GGT)的Corynebacterium glutamicum SYPA5-5表达系统,验证该蛋白信号肽片段在宿主表达体系中的作用,并将该体系应用于高效合成茶氨酸的研究。【方法】将该ggt基因和切除信号肽的片段基因(?sp ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中克隆表达。以C.glutamicum SYPA5-5高产L-精氨酸培养基为基础进行重组菌产酶优化。最优转化条件为:L-谷氨酰胺∶乙胺为1∶3,酶量为0.06 U/mL。采用底物流加策略高产L-茶氨酸,40 mL的转化体系包含:终浓度为0.9 U/mL的GGT,pH 10,37℃,从0 h开始每隔2 h补加20 mmol/L的L-谷氨酰胺,60 mmol/L的乙胺。【结果】C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-ggt发酵上清液中GGT酶活达到(4.69±0.34)U/mL,C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-?sp ggt只检测到胞内酶活(0.99±0.17)U/mL,说明利用B.subtilis来源的信号肽可以实现GGT在C.glutamicum体系中分泌表达。最适产酶培养基条件为:葡萄糖浓度为10%;IPTG最适添加时间为0 h。批次流加在12 h时达到最大茶氨酸产量104.36 mmol/L,转化率为86.9%。【讨论】本文首次实现B.subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中分泌表达,通过分批流加底物获得目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。     

半胱氨酸合成酶与β-氰基丙氨酸合成酶活性检测

植物半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CSase)和β-氰基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase,β-CAS)分别催化合成半胱氨酸(Cysteine,Cys)和β-氰基丙氨酸(β-Cyanoalanine,β-CA),它们在功能上冗余。本研究以山黧豆、苜蓿和玉米为主要材料,结合电泳对8种常见植物CSase和β-CAS粗酶活性进行了分析。结果表明,检测CSase活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为10min,最适pH均为8.0,底物O-乙酰-丝氨酸和Na2S最适浓度分别是10和5 mmol·L-1。检测β-CAS活性时,8种植物两类粗酶的最适反应时间均为30min,最适pH均在9~10范围内,底物Cys最适浓度均为3mmol·L-1,而底物KCN最适浓度前者为80mmol·L-1,后者为3mmol·L-1。8种植物中,CSase活性在种、种内组织间差别不是很大,但β-CAS活性则相反,尤其在茎叶和根中差别较大。     

运用氨基酸分析法和DOE法优化抗PD-1单克隆抗体生产用培养基

本研究采用氨基酸分析法结合DOE设计法优化并获得高表达抗PD-1单克隆抗体生产用基础和补料培养基。通过对市售多种基础和补料培养基进行筛选,获得细胞生长状况较优的基础培养基和抗体表达较高的补料培养基,利用氨基酸分析法检测较优基础培养基和补料培养基中氨基酸消耗情况,确定影响细胞生长和抗体表达的关键氨基酸种类,利用DOE分析软件设计分别在较优基础和补料培养基中添加不同浓度的氨基酸种类及浓度,根据细胞生长及抗体表达,优化得到抗PD-1单克隆抗体的基础和补料培养基组合。最终优化后基础培养基配方为:Hycell CHO培养基中添加1.04 mmol/L L-天冬酰胺和0.76 mmol/L L-谷氨酰胺。最终优化后补料培养基配方为:OPM CHOCD Feed1补料培养基中添加38.7 mmol/L L-组氨酸,75.0 mmol/L L-酪氨酸,64.0 mmol/L L-丝氨酸,49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸。经过3 L反应器培养验证,优化后的培养基比未优化时,最大活细胞密度(PVCD)提高了62.7%,抗PD-1单克隆抗体表达量提高了71.5%,且活性无明显差异。