Vero细胞和脊髓灰质炎病毒在无血清条件下的培养探究

目的：探索Vero细胞和脊髓灰质炎病毒在无血清条件下的最佳培养条件,为无血清培养Vero细胞生产脊髓灰质炎疫苗奠定基础。方法选择直接适应（直降组）和序贯适应（驯化组）两种无血清培养方法,观察Vero细胞和脊髓灰质炎病毒在无血清条件下的生长情况,并检测脊髓灰质炎病毒及其病毒滴度。结果 Vero细胞在两种无血清条件下均生长良好,其中驯化组细胞生长速度更接近对照组。以脊髓灰质炎病毒Sabin株Ⅰ型分别感染直降组、驯化组和对照组细胞的病毒滴度平均值分别为8．94、8．81和8．94 LgCCID50/mL;Ⅱ型病毒滴度平均值分别为8．84、8．25和7．94 LgCCID50/mL;Ⅲ型病毒滴度平均值分别为8．91、8．57和8．63 LgCCID50/mL;且3组的变异系数（ CV）均小于10％。结论 Vero细胞在无血清条件下生长良好,无血清培养的Vero 细胞可用作脊髓灰质炎疫苗生产的基质。     

栗疫病菌的营养体亲和性基因和dsRNAs对病毒传播的影响

研究了栗疫病菌（Ｃｒｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｐａｒａｓｉｔｉｃａ（Ｍｕｒｒ）．Ｂａｒｒ）营养体亲和性基因及ｄｓＲＮＡ病毒对菌株间病毒特征与传播影响,试验选用已知４个ＶＣ基因座位的１５个ＶＣ基因型菌株和３种ｄｓＲＮＡ病毒,通过含病毒菌株与野生型菌株的配对培养,将病毒逐个转入不同ＶＣ基因型菌株,将不同ＶＣ基因型的含病毒菌株与具特定ＶＣ基因差异的野生型菌株配对培养,根据培养两周后野生型菌株培养性状的改变与否     

Beagle狗肾细胞及用于制备乙脑活疫苗的研究

Ｂｅａｇｌｅ乳狗（５－１０日龄）肾块用热消化法制成细胞批放液氮保存,检定合格后做下列试验：（１）复苏培养长满单层后更换维持液,其细胞能维持４天以上,克服了常规消化培养细胞维持时间短（３６小时）的缺陷。（２）传代１４－２株病毒时,１代病毒的滴度即达６．０４－６．２４ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ,１代后的各代（至１１代）病毒滴度无明显提高。（３）该细胞接种１４－２株病毒时不产生明显的破坏性病变（ＣＰＥ）,在收毒前采取冻溶１次比冻溶前的病毒滴度提高０．２７－０．５ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ。以ＢＤＫ细胞传１代的１４－２株病毒作生产毒种,收毒前冻溶１次等工艺法制备五批疫苗,全面检定结果均符合《乙脑活疫苗规程》的质量标准。其中病毒滴度为６．０９－６．２４ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ;免疫效价（ＩＤ５０＝ｍｌ）为１．９－４．０×１０－５,与相同滴度的原毒株１４－２ＰＨＫ苗对照无明显差异（ｔ＝０．９６８Ｐ＞０．０５）,表明其免疫原性与原毒株相似。     

微载体培养中不同感染剂量的麻疹病毒对病毒产量的影响

用微载体培养法在搅拌瓶和生物反应罐中小规模培养麻疹病毒,以探索在可能实现的大规模工业化麻疹生产中不同感染剂量ＭｕｌｔｉｐｌｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｍ．ｏ．ｉ）的麻疹病毒对病毒产量的影响。增加ｍ．ｏ．ｉ可以将病毒的高峰期提前两到三天,但病毒产量却并不因此而提高,还有可能引起微载体上贴附的细胞层损坏加剧,从而被迫过早终止培养,导致病毒总产量下降。     

毛壳素显著抑制柯萨奇病毒 B3的体外复制

柯萨奇病毒B3（CVB3）是一种常见的人类病原体,与多种疾病有关。本研究旨在探讨球毛壳菌代谢产物毛壳素对CVB3在体外培养细胞系中复制的影响。结果显示,毛壳素显著抑制CVB3在体外培养细胞系中的复制。250 nmol/L毛壳素可使 CVB3感染的 HeLa细胞相对存活率从未加毛壳素时的（21．9±1．8）％提高至（70．1±4．3）％。同时,毛壳素处理的HeLa细胞中病毒产量仅为对照组的（5．3±0．8）％,而病毒RNA水平也仅为对照组的（13．0±8．3）％。毛壳素也可使CVB3感染的Vero细胞相对存活率从（64．6±1．7）％提高至（87．2±4．8）％。毛壳素的这种抑制作用可被抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸部分抑制。研究毛壳素抑制病毒复制的具体作用机制将有助于新型抗病毒药物的研制。     

药物对病毒感染培养心肌细胞Ca~（2＋）内流及CVB_3－RNA复制的影响

应用放射性同位素￣（４５）Ｃａ￣（２＋）示踪技术及光敏生物素标记ｃＤＮＡ探针杂交方法,观察了维拉帕米、黄芪、地塞米松等药物对感染柯萨奇Ｂ＿３病毒（ＣＶＢ＿３）的大鼠培养心肌细胞Ｃａ￣（２＋）内流及细胞中ＣＶＢ＿３－ＲＮＡ复制的作用。结果发现：在病毒感染４８ｈ,上述三药均可显著减少感染细胞及正常对照的心肌Ｃａ￣（２＋）内流（Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０５）;若在病毒感染后即加入上述药物,经４８ｈ培养后,黄芪组细胞中的ＣＶＢ＿３－ＲＮＡ含量显著少于病毒对照组（Ｐ＜０．００１）,维拉帕米则显著增加（Ｐ＜０．０１）．而地塞米松对其无影响。提示黄芪与地塞米松具有一种与维拉帕米相似的减少病毒感染心肌Ｃａ￣（２＋）内流的作用,有可能减轻感染细胞的继发性Ｃａ￣（２＋）损伤;但三种药物对感染细胞中病毒核酸的复制有不同作用,可作为临床治疗病毒性心肌炎时的参考。     

大鼠细小病毒H-1株培养方法的建立

目的建立用大鼠胶质瘤细胞系（Rat glial cell line C6）替代大鼠原代胚细胞（primary rat embryocells,RE）培养大鼠细小病毒（Toolan virus,H-1）的方法。方法 将0.8 mL H-1病毒接种C6细胞（75T培养瓶,细胞接种量为2×105/mL,培养过夜）,待细胞病变CPE达＋＋～＋＋＋时,用免疫荧光（FITC）鉴定所培养病毒的抗原,用血球凝集试验（HA）测定培养物上清效价,用DNA测序鉴定所培养的病毒,用96孔板培养法测定H-1病毒的TCID50。结果H-1在接种到C6细胞的第3～4天,细胞发生明显的病变,CPE可达＋＋＋＋,FITC鉴定呈H-1抗原阳性,病毒的培养上清中HA效价为1∶320。测序结果表明：该病毒序列与NCBI中H-1序列同源性达99%,确定为H-1病毒。收获的H-1的TCID50为103.2/0.1 mL。结论用大鼠胶质瘤细胞系（C6）可以替代大鼠原代胚细胞（RE）进行大鼠细小病毒的培养。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒规模化生产培养工艺的建立

目的通过对发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（简称“新布尼亚病毒”）进行规模化生产培养工艺研究,为新布尼亚病毒规模化生产提供有力支持。方法采用细胞工厂培养Vero细胞,待其长成致密单层后,取工作种子批新布尼亚病毒毒种接种细胞,采用连续收获或细胞病变充分时收获培养液上清的方法收获病毒,并以病毒滴度、抗原含量作为评价指标选择基础培养基、培养基pH、人血白蛋白添加浓度、接种细胞日龄、接种病毒MOI以及病毒培养温度。结果按0．01-0．001MOI接种3-4日龄Vero细胞,病毒培养液选择含0．3％人血白蛋白pH7．6-7．8的DMEM溶液,35℃培养7d收获,病毒收获液病毒滴度7．87LgCCID50／mL、抗原含量170．1μ/mL。结论初步建立了新布尼亚病毒规模化生产培养工艺,为后续工业化生产提供了数据支持。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的RNA酶活性及其研究进展

猪瘟病毒（CSFV,Classicalswinefevervirus）属于黄病毒科瘟病毒属,同属的成员还有牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和羊的边界病病毒（BDV）。猪瘟病毒是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组大小约12．3kb,含有一个大的ORF,此ORF编码一个大的多聚蛋白,经宿主和病毒编码蛋白酶的共同作用,在共同翻译中和／或翻译后,将此多聚蛋白加工成病毒的结构蛋白和非结构蛋白．猪瘟病毒基因组的5＇端编码病毒结构蛋白,即衣壳蛋白（C）和三个囊膜糖蛋白（E0、E1、E2）。其中E0和E2能够刺激机体产生中和抗体,并使猪获得免疫力[1,2]．意外发…     

感染流行性出血热病毒的正常人骨髓细胞膜脂和酶生物活性的研究

采用疏水性荧光探针ＤＰＨ（１,６,－苯基－１,３;５－已三烯）标记感染了流行性出血热病毒的正常人骨髓细胞的细胞膜,根据荧光偏振值的变化推导出膜脂流动性,同时通过细胞组化染色定量方法,测定细胞内酸性磷酸酶（ＡＣＰ）和琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）的活性。动态观察１、６、２４、７２ｈ培养后的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞,发现感染后细胞膜脂的流动性明显降低,并随培养时间的延长而明显,和正常对照组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５～０．０１）。通过组化染色和显微分光光度计单细胞扫描定量认为：感染细胞在培养开始的７２ｈ内ＡＣＰ、ＳＤＨ升高,１２０ｈ后明显下降,和正常相比亦有显著差异（Ｐ＜０．０５）,这与病毒侵犯和细胞机能的受损程度有关。     

清洁级实验动物四种病毒抗体玻片酶免疫检测试剂盒的研制

本文报道对清洁级实验动物应排除的四种病毒（淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、小鼠脱脚病病毒、鼠肝炎病毒和仙台病毒）抗体玻片酶免疫（ＥＩＡ）检测试剂盒的研制。四种病毒感染的细胞和对照细胞经冷丙酮固定于载玻片上制成特异性抗原和对照抗原,此四种病毒的抗血清各１０份和ＳＰＦ小鼠血清２０份分别与四种病毒的特异性抗原和对照抗原进行ＥＩＡ交叉试验,结果显示,抗原只与其相应抗血清发生特异性显色反应,与非特异性小鼠血清和ＳＰＦ小鼠血清不显色。与ＨＩ或ＥＬＩＳＡ方法比较,通过对１１２份普通小鼠血清进行测试,结果表明,ＥＩＡ对仙台病毒抗体的检出率（１９．６％）显著高于（＜０．００５）ＨＩ（６．３％）,对小鼠脱脚病病毒抗体的检出率（２３．３％）与ＨＩ（２１．４％）无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。ＥＩＡ对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和鼠肝炎病毒抗体的检出率分别为１．８％和７１．２％,ＥＬＩＳＡ对两种病毒抗体的检出率分别为１．８％和６７．６％,两种方法对两种病毒抗体的检出率无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。重复性试验表明两批四种病毒抗体试剂盒对１０８份小鼠血清两次测定的符合率为９６～１００％。四种病毒的ＥＩＡ抗原在－１８℃保存１２个月或在２－８℃保存３     

应用细胞工厂建立人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺

目的为提高生产效率、增加原代地鼠肾细胞单产量及狂犬病病毒产量,建立人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）连续培养多次收获工艺。方法选用12-14日龄SPF地鼠,无菌取肾经消化,制备成细胞悬液,分装到40层细胞工厂并培养细胞成单层;接种狂犬病病毒固定毒aG株,连续培养病毒并多次收获。分别对同一细胞批制备的多个单次病毒收获液的免疫原性、病毒滴度和地鼠肾细胞蛋白质含量进行检测。结果用40层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和狂犬病病毒,细胞接种浓度为1．0×10。～1．5x10。cells／mL,（36±1）℃培养72h成致密单层;按0．1MOI病毒接种,可进行6次收获病毒;多个单次病毒收获液病毒滴度均不低于6．0lgLD50／mL;免疫原性检查保护指数不低于100;地鼠肾细胞蛋白质残留量随着收获次数的增加而不断降低。结论用细胞工厂建立了人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺,能显著提高地鼠。肾单产量,增加产能。     

ToRCH系列酶标诊断试剂的研制

报道了用辣根过氧化物酶标记的抗人ＩｇＧ和抗人ＩｇＭ（ｕ链）单克隆抗体作第二抗体,用自己培养、纯化的弓形体（Ｔｏ）、风疹病毒（ＲｕＶ）、巨细胞病毒（ＣＭＶ）和单纯疱疹病毒（ＨＳＶ１２）的虫体和病毒抗原包被酶标板,研制出检测ＴｏＲＣＨ系列的特异性ＩｇＧ和ＩｇＭ的间接ＥＬＩＳＡ试剂。质量检定结果表明,该试剂特异性强、本底低,能有效消除ＲＦ因子等干扰因素的影响;灵敏度达１∶１６０～６４０;精密性好,变异系数（Ｃ．Ｖ）在１．４％～９．０％;试剂稳定,３７℃存放４ｄ,各项指标的变化率不超过１５％。     

S/D处理人纤维蛋白原的病毒灭活验证

在人纤维蛋白原制备工艺中增加Ｓ／Ｄ处理灭活病毒步骤,ＴＮＢＰ和Ｔｗｅｅｎ８０终浓度分别为０．３％和１％,在２５℃处理６小时能有效灭活指示病毒ＶＳＶ（〉３．７５Ｌｏｇ）、Ｓｉｎｄｂｉｓ（〉４．４６Ｌｏｇ）、ＨＩＶ（〉３．６７Ｌｏｇ）,盲传三代未检出病毒     

棉铃虫病毒杀虫乳悬剂的生产及其药效试验

成功研制出棉铃虫病毒（ＮＰＶ）杀虫乳悬剂,改进了生产工艺和设备,建立了棉铃虫的室内品系,提高了生产效率,建立了产品的检测方法,提高了产品质量,促使棉铃虫病毒杀虫剂商品开发获得成功。大田试验证明,病毒乳悬剂的防治效果,相当于当前推广的化学农药,优于原病毒可湿性粉剂。相同剂量（０．５３一１．０７×１０（１０）ＰＩＢ／公顷）的病毒乳悬剂可使虫口平均减退９１．７％,而病毒可湿性粉剂为８３．７％。     

标记抗体染色病毒空斑计数技术的研究

用细胞病变阳性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ＋ ）病毒马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ, ＭＤＶ）血清１,２,３ 型以及细胞病变阴性（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ－ ）病毒猪瘟病毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）强毒与弱毒和鸡新城疫病毒（Ｎｅｗ ｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ． ＮＤＶ）Ｌａｓｏｔａ 毒株及其对应的异硫氢酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的特异抗体为试验材料,以免疫荧光抗体技术（ＦＡ）为基础、并加以改进,建立了标记抗体染色病毒空斑计数技术． 该技术不仅能克服常规病毒空斑计数技术不能计数细胞病变阴性病毒和一种样品含有两种或两种以上病毒的各自空斑数的缺点,能迅速准确计数出ＣＰＥ－ 病毒和多病毒样品中病毒各自空斑数及其空斑总数,具较高敏感性、良好的可重复性．     

提高火鸡疱疹病毒疫苗效价方法的研究

火鸡抱疹病毒（HVT）疫苗主要用于预防鸡马立克病（MD）,是一种应用广泛的常规疫苗。由于HVT是细胞结合病毒,难于培养,病毒效价低,导致孩疫苗生产工艺复杂,工作最大,成本高。本实验对ffiry的传统生产方法进行了改进。按常规方法制备鸡胚成纤维细胞（CEF）,37℃培养19h后接种HVT,显微镜F随时观察病变（CPE）情况,于CPE达10％、30％、扣％时添加等级的健康细胞,继续培养至CPE达洲％时,收获培养物。本实验发现,在CPE达对％肘添加细胞所收获的培养物,蚀斑数（PFU）最高,病毒量最大,可达用＿IE常方法培养的病毒量的2…     

腺病毒、腺相关病毒载体转导心肌细胞的研究

目的和方法：构建含人β2肾上腺素能受体（β2－AR）基因的重组腺病毒(rAd) 和腺相关病毒（rAAV),并感染体外培养的心肌细胞,检测目的基因在心肌细胞内的表达。结果：RT－PCR检测结果显示感染的心肌细胞均表达人β2-ARmRNA,western印迹杂交显示感染的心肌细胞可表达人β2－AR蛋白;放射性配基检测表明两种重组病毒感染的心肌细胞的β－AR密度无明显差异（P＞0．05）,但均高于对照组（P＜0．01）。结论：腺相关病毒（AAV）载体与腺病毒载体均中有效的转染心肌细胞并使目的基因表达。     

白纹伊蚊垂直传播乙型脑炎病毒的研究

用５株乙型脑炎病毒（ＪＥｖｉｒｕｓ）经口感染白纹伊蚊,证明该蚊能感染和传播乙型脑炎病毒,对感染雌蚊的１和子２代卵３４４３粒,幼虫７０２１只和成虫４８５３只,分１７１批检查乙型脑炎病毒,子１代的批阳性率,卵为４６．６７％（１４／３０）,幼虫为２１．２１％（７／３３）。雌性成虫为２３．７８％（９／３８）,雄性成虫为１５．００％（３／２０）;子２代幼虫,雌性和雄性成虫和批阳性率依次为２３．５３％（４／１     

三倍体欧州山杨的试管繁殖

InvitroPropagationofPopulustremulaCAOChuan－Jian(NingxiaResearchCentreofForestryProtection,Yinchuan750004)RENYu-Fen,HUANGHui(NingxiaForestryResearcgInstitute,Yinchuan750004)1植物名称三倍体欧州山杨（Populus．tremula）。2材料类别由德国引进的无病毒三倍体植株顶芽、腋芽。3培养条件不定芽诱导培养基为：（1）MS＋BA0．5mg·L－1（单位下同）;（2）MS＋BA1＋IAA0．2;（3）MS＋BA1．5＋IAA0．2;（4）MS＋BA2＋IAA0．2。生根培养基为：（5）MS＋IBA0．1＋NAA0．1;（6）1／2MS＋IBA0．1＋NA…