诺如病毒常见流行株胶体金免疫层析快速检测方法

【背景】诺如病毒是全球引发急性胃肠炎的最主要病原之一,具有丰富的遗传多样性。【目的】建立一种简便快捷、适用于诺如病毒常见流行株的胶体金免疫层析检测方法。【方法】将抗诺如病毒衣壳蛋白的单克隆抗体1B10作为金标抗体、抗诺如病毒衣壳蛋白的单克隆抗体1D6作为检测线、羊抗鼠抗体作为质控线组装成胶体金试纸条。对试纸条的组装条件进行优化,确定最佳标记pH、金标抗体最佳浓缩比例及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最佳划线浓度等。对新方法进行性能评价,包括灵敏性试验、特异性试验、保存期试验及符合率实验等。【结果】所建立的诺如病毒胶体金试纸条检测方法最低检测浓度为5.9×105copies/μL。本方法与常见的腹泻病毒,如轮状病毒、星状病毒、腺病毒、肠道病毒均无交叉反应。批次间与批次内重复较好,保存期试验表明试纸条至少可以室温密封干燥保存一年时间。应用所建立的胶体金检测方法对24份临床粪便样本进行检测,检测结果与实时荧光RT-PCR方法的阳性符合率约为83%(15/18),常见流行株GII.2型、GII.4型、GII.17型均被成功检出。【结论】建立的胶体金试纸条检测方法具有较好的特异性与稳定性,可用于诺如病毒常见流行株检测及大规模流行病学调查。     

神经元特异性烯醇酶和癌胚抗原胶体金免疫层析联合检测

目的:应用双抗夹心胶体金免疫层析方法,实现对神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)两种肺癌肿瘤标志物的快速联合检测。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒,并分别对鼠抗NSE、CEA单克隆抗体进行标记,分别与之相配对的另一种单克隆抗体被喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上,制成免疫层析检测试条。溶液中的抗原NSE、CEA与金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上固定的抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果:该试纸条只与NSE、CEA有特异性反应,与CA125、CYFRA21-1、TPA等肺癌标志物无交叉反应。标准样品中两种抗原的检测灵敏度分别可达到5ng/mL和3ng/mL。结论:胶体金免疫层析技术检测NSE、CEA特异性强、灵敏度高、简便快速,不需特殊仪器设备,有广泛应用价值。     

人肺炎链球菌快速检测胶体金试纸的研制

[目的]研制一种快速检测人肺炎链球菌(S. pneumoniae)的免疫胶体金层析试纸。[方法]对肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)基因序列(Gen Bank:U89711)作生物信息学分析,选取抗原表位强、种内同源性高的片段克隆表达纯化重组蛋白rPspA,并免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;以双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸,并对其特异性、灵敏度以及稳定性进行验证分析。[结果]制备的胶体金试纸对rPspA最低检测限达到0. 1pg/m L,可在15min内完成对肺炎链球菌的检测,与其他10种重要呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃条件下保存6个月仍具有良好的重复性和稳定性。[结论]PspA蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为Sp的检测标志物,以其抗体为基础制备的胶体金免疫层析试纸,适用于Sp菌感染的临床快速检测。     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人绒毛膜促性腺激素

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法研制用于早孕检测的快速定量层析试纸条。方法:应用EDC/NHS法标记纳米磁珠、Biodot喷膜仪喷点NC膜、双抗体加心法建立免疫层析试纸条、对磁信号进行检测并与ELISA实验做对比,并对结果进行评价。结果:建立了HCG纳米磁性免疫层析试纸条,检测到底线为1miu/ml的HCG抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准;用此方法与商品化免疫胶体金试纸条对临床样本进行检测,检测符合率达99%,与ELISA法比较符合率达100%,且检测时间控制在5min以内。结论:该方法简单快速,灵敏度高,不仅可以应用于HCG的检测,同时为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。     

一种超高灵敏的埃博拉病毒胶体碳侧流免疫层析检测方法的建立

埃博拉出血热 (Ebola hemorrhagic fever, EHF) 由于其高感染性和高致死率特点,快速鉴别诊断并实施隔离是最有效的防止疫情扩散的措施。文中建立了一种可以快速、高灵敏筛查埃博拉病毒 (Ebola virus,EBOV)感染的现场检测技术,用碳纳米颗粒标记抗EBOV基质蛋白VP40兔多克隆抗体,组装成一种可在15 min内检测埃博拉病毒的胶体碳侧流免疫层析试纸条。将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫;以1 mg/mL的抗VP40单克隆抗体 (McAb,4B7F9) 和羊抗兔IgG,按照2 μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上,分别作为检测线与质控线,组装试纸条。该试纸条能够特异地检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP) 和灭活EBOV,而与马尔堡病毒样颗粒 (MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8 (IAV/PR/8)、黄热病毒 (YFV-17D)、登革热病毒2型 (DEN2) 无交叉反应,显示良好的特异性,对1 500份阴性血清进行检测,假阳性率为1.3‰,仅为WHO授权ReEBOV?胶体金试纸的1/100;该胶体碳试纸条检测灭活EBOV的最低检出限为100 ng/mL (相当于106 copies/mL),远优于ReEBOV?胶体金试纸条检出限 (10 μg/mL,相当于108 copies /mL)。热稳定性评价显示试纸条可在室温稳定保存1年以上。文中建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、超高灵敏、特异地检测EBOV,为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。     

神经元特异性烯醇酶和癌胚抗原胶体金免疫层析联合检测

目的：应用双抗夹心胶体金免疫层析方法,实现对神经元特异性烯醇化酶（NSE）和癌胚抗原（CEA）两种肺癌肿瘤标志物的快速联合检测。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒,并分别对鼠抗NSE、CEA单克隆抗体进行标记,分别与之相配对的另一种单克隆抗体被喷在硝酸纤维素膜（NC膜）上,制成免疫层析检测试条。溶液中的抗原NSE、CEA与金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上固定的抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果：该试纸条只与NSE、CEA有特异性反应,与CA125、CYFRA21-1、TPA等肺癌标志物无交叉反应。标准样品中两种抗原的检测灵敏度分别可达到5ng/mL和3ng/mL。结论：胶体金免疫层析技术检测NSE、CEA特异性强、灵敏度高、简便快速,不需特殊仪器设备,有广泛应用价值。     

以核糖体蛋白L7/L12为分子标志物精准检测肺炎链球菌的研究

目的:以核糖体蛋白L7/L12为标志物,探索一种胶体金免疫层析法快速检测肺炎链球菌的方法。方法:分析核糖体蛋白L7/L12基因序列,构建原核表达载体,表达纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;利用无标记分子相互作用仪检测抗原抗体亲和力;以双抗夹心法研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性及稳定性进行验证分析。结果:筛选得到两株高效分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,两种单克隆抗体均与抗原有高的亲和力并且无竞争,制作的试纸最低检出限为1. 0×105CFU/ml;其与肺炎链球菌有特异性反应,而与其它9种常见呼吸道病原菌均无交叉反应;试纸条在25℃下保存12个月仍具有良好的重复性和稳定性。结论:RP-L7/L12可作为肺炎链球菌的检测标志物,以其单抗制备的胶体金免疫层析试纸可适用于肺炎链球菌的快速检测。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型抗体胶体金检测试纸条的制备和分析

【背景】由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2, CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失。【目的】开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2和监测鲫CyHV-2IgM抗体水平的胶体金检测试纸条。【方法】将CyHV-2与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66多克隆抗体进行划线作为质控线，分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件，确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度，以及检测线(test line, T线)、质控线(control line, C线)最适划线浓度等。【结果】本研究制备的CyHV-2抗体胶体金试纸条可以使用全血测试，与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应，如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等。试纸条最低限度可以检测到1:100稀释的阳性血清抗体，由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平。试纸条通过对10条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194—2018)进行Kappa分析，Kappa值为0.80，表明二者有较高的符合...     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人乙型肝炎表面抗原

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法,研制可应用于乙肝表面抗原(HBsAg)快速定量检测的层析试纸条。方法:用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的方法标记纳米磁珠,喷膜仪喷点硝酸纤维膜;根据双抗体夹心法原理建立免疫层析试纸条,对HBsAg特异性抗体捕获的磁信号进行检测,并对磁信号检测结果进行统计学分析和评价。结果:建立了HBsAg纳米磁性免疫层析试纸条,最低限度检测为0.1 ng/mL的HBsAg抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准,且检测时间控制在5 min内;经检测临床血清标本证实,该方法可根据磁信号定量检测乙肝患者血清中HBsAg的浓度。结论:HBsAg纳米磁性免疫层析方法具有简单快速、灵敏度高的特点,可应用于临床血清样本中HBsAg的检测;该方法为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.