神经元特异性烯醇酶和癌胚抗原胶体金免疫层析联合检测

目的:应用双抗夹心胶体金免疫层析方法,实现对神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)两种肺癌肿瘤标志物的快速联合检测。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒,并分别对鼠抗NSE、CEA单克隆抗体进行标记,分别与之相配对的另一种单克隆抗体被喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上,制成免疫层析检测试条。溶液中的抗原NSE、CEA与金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上固定的抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果:该试纸条只与NSE、CEA有特异性反应,与CA125、CYFRA21-1、TPA等肺癌标志物无交叉反应。标准样品中两种抗原的检测灵敏度分别可达到5ng/mL和3ng/mL。结论:胶体金免疫层析技术检测NSE、CEA特异性强、灵敏度高、简便快速,不需特殊仪器设备,有广泛应用价值。     

甲胎蛋白胶体金检测试剂的的研制

为建立一种快速,简易胶体金免疫层析法（GICA）用于检测血清中的甲胎蛋白（AFP）,将AFP单克隆抗体分别标记胶体金并包被硝酸纤维素膜,制成免疫检测层析试剂,血清中的AFP与金标记抗体结合,沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合可形成肉眼可见的紫红色线条,此检测试剂对本室自制AFP参比品进行了检测,灵敏度达20ng/ml;对甘肃省肿瘤医院的176份癌症患者血清进行了检测。结果与ELISA法相一致,本法检测AFP快速,简便,结果准确,具有推广价值。     

甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析同步检测

目的:探讨建立一种同时快速检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)两种肿瘤标志物的方法.方法:用胶体金分别标记鼠抗AFP单克隆抗体和鼠抗CEA单克隆抗体,喷于胶金垫上.与之配对的抗体喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上分别做检测线T2和T1,兔抗鼠二抗喷在NC膜上做质控线,利用免疫层析技术进行检测.结果:采用Frens方法制备的胶体金粒径在20nm,紫外可见吸收峰在521 nm处,金标抗体的最适pH在9.0,最适抗体量为200μl,胶体金标记2.4μg抗体.测试结果表明同时检测AFP和CEA的试纸条灵敏度分别为20 ng.mL-1和5 ng.mL-1,检测时间仅需10min,与PSA、CA125、CA15-3、Ferritin、Human Albumin等没有交叉反应,稳定性好.结论:应用胶体金免疫层析技术,实现了AFP和CEA的同步检测.     

心肌肌钙蛋白I和糖原磷酸化酶同工酶BB金标记免疫层析联合检测法的建立

目的：建立人心肌肌钙蛋白I（cTnI）及糖原磷酸化酶同工酶BB（GPBB）的胶体金免疫层析联合检测法。方法：以纯化的人心肌cTnI和GPBB为免疫原免疫小鼠,制备抗cTnI和抗GPBB单克隆抗体,并用胶体金标记cTnI和GPBB抗体,采用免疫层析技术建立快速准确检测cTnI和GPBB的胶体金免疫层析法。结果：建立的检测方法灵敏度高,可检出血液样品中1ng／mL的cTnI和7ng／mL的GPBB;特异性强,与心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白C、肌酸激酶同工酶均无交叉反应。结论：该方法特异性强,灵敏度高,快速、简便,弥补了传统心肌梗死诊断方法的不足,对急性心肌梗死的早期筛查有重要意义,具有较高的临床应用价值和广泛的应用前景。     

基于上转磷光颗粒的AFP免疫层析定量检测

目的：建立了上转磷光免疫层析快速定量检测AFP的方法,用于原发性肝癌的诊断。方法：利用上转磷光标记的双抗夹心免疫层析技术检测血清中AFP的含量。将AFP单克隆抗体分别标记上转磷光颗粒并包被硝酸纤维膜,制成免疫层析检测试纸。评价该试纸的灵敏度、特异性和精密度。并通过临床50例血清样本,探讨上转磷光技术与化学发光检测方法的一致性。结果：该方法能在20min内完成,检测灵敏度达5ng/ml。浓度范围从5-1000ng/ml作标准曲线,呈现较好的线性。通过三组平行实验探讨其精密度,变异系数都在10%以内。应用于其它肿瘤标志物如CEA、CA199、AFU和NSE的检测,无交叉反应。与化学发光相比,决定系数R2=0.9692,一致性较好。结论：该方法简便、快速、廉价,可以实现定量,尤其适合基层门诊和体检现场使用。     

青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用

目的研制青霉素结合蛋白2a(PBP2a)单克隆抗体(Mc Ab),为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)免疫层析检测方法提供检测用抗体。方法以基因工程抗原r PBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术(Western blotting)分析单克隆抗体特异性。选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法。结果共获得11株分泌抗r PBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应。用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5~20 min内完成检测。结论获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法。     

胶体金渗滤方法检测乙肝患者血清中乙肝核心抗体的研究

目的:建立胶体金免疫渗滤法检测乙肝患者血清中乙肝核心抗体(anti-HBc Ig M)抗体的方法,评价其灵敏度、特异性和重复性。方法:预先在硝酸纤维素膜上包被乙肝核心抗原HBc Ag,将血清或者血浆加在硝酸纤维素膜上,血清或者血浆中的anti-HBc Ig M与HBc Ag结合。洗涤去掉非特异结合,加入胶体金标记的抗人-Ig M,洗涤去掉没有结合的抗人Ig M抗体。硝酸纤维素膜上的抗原-Ig M-抗人Ig M形成的"三明治"复合物呈现红色圆点,证实实验有效。结果:102份乙肝患者血清,anti-HBc Ig M阳性标本99份。检出率97%。50份正常血清中,有一份检测结果弱阳性,特异性98%。结论:胶体金免疫渗滤法检测anti-HBc Ig M敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要特殊的仪器设备,在anti-HBc Ig M快速检测上有广阔的应用前景。     

一种快速检测甲型流感病毒的方法

目的 开发一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法（GICA）的试剂盒,以用于对甲型流感病毒的检测。方法以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗甲型流感病毒内部抗原的单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被两种抗甲型流感病毒单克隆抗体的混合液,制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合,后移动至硝酸纤维素上与固定的单克隆抗体发生反应,形成肉眼可见的红色带。结果GICA试纸条与甲1型和甲3型流感病毒共16种毒株均能发生特异性反应,与乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒无交叉反应。用三种不同甲型流感病毒毒株的不同浓度标本与美国同类经过FDA批准的产品比较,灵敏度相同。结论GICA试纸条灵敏度能够达到临床使用的要求,并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点,对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。     

胶体金免疫层析法检测猪链球菌2型的研究

目的:制备胶体金免疫层析试纸检测猪链球菌2型.方法:用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒,标记猪链球菌2型多克隆抗体,通过免疫层析作用对猪链球菌2型进行检测,并对试纸条的敏感性、特异性、稳定性进行评价.结果:每毫升胶体金最佳抗体标记量为22μg/mL,最佳包被抗体浓度为2 mg/mL,最佳BSA封闭浓度为1.5%,建立的胶体金免疫层析试纸条栓出猪链球菌2型的下限为106 CFU/mL,从检测到结果判断时间为5～15 min,与其他常见致病菌及链球菌属中15个群无交叉反应.结论:获得了检测猪链球菌2型的胶体金免疫层析试纸,该法操作简便,灵敏度高,特异性强,可用于猪链球菌的快速初筛和检测.     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人乙型肝炎表面抗原

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法,研制可应用于乙肝表面抗原(HBsAg)快速定量检测的层析试纸条。方法:用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的方法标记纳米磁珠,喷膜仪喷点硝酸纤维膜;根据双抗体夹心法原理建立免疫层析试纸条,对HBsAg特异性抗体捕获的磁信号进行检测,并对磁信号检测结果进行统计学分析和评价。结果:建立了HBsAg纳米磁性免疫层析试纸条,最低限度检测为0.1 ng/mL的HBsAg抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准,且检测时间控制在5 min内;经检测临床血清标本证实,该方法可根据磁信号定量检测乙肝患者血清中HBsAg的浓度。结论:HBsAg纳米磁性免疫层析方法具有简单快速、灵敏度高的特点,可应用于临床血清样本中HBsAg的检测;该方法为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

新型冠状病毒胶体金抗原快速检测试剂的研制及性能评价*

目的:建立新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)胶体金抗原快速检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,用鼠抗核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)单克隆抗体及二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)作为标记抗体,硝酸纤维素膜上分别包被鼠抗核衣壳蛋白单克隆抗体和兔抗DNP多抗作为检测线和质控线制备免疫胶体金试纸条;对试剂最低检出限、交叉反应性、加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果:检测热灭活培养物的最低检出限为2.0×10² TCID₅₀/mL;测试16种常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应;试剂盒50℃加速破坏8周稳定。临床及健康人群鼻咽拭子样本测试,诊断灵敏度为96.67%(29/30),特异性为99.23%(129/130),总符合率为98.75%(158/160);一致性检验Kappa值为0.959 0,P<0.05。结论:SARS-CoV-2胶体金抗原快速检测试剂检测灵敏度和特异性高,检测速度快,操作便携,无需设备,肉眼观察,可作为现有核酸检测法的补充手段,用于新型冠状病毒的早期筛查。     

便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡的研制

采用鼠抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体1和胶体金标记鼠抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体2及对照抗体羊抗鼠IgG,利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原,在5 min内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡,用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病.应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白(Hb)抗体(McAb);ELISA方法检测McAb效价;免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡.ELISA法检测McAb效价的结果显示,鼠抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体1效价为1∶3.2×l03;鼠抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体2效价为l:1.6×103.试卡的灵敏度检测结果显示,检测粪便中血红蛋白的最低浓度为0.1μg/mL;试卡的特异性检测结果显示,特异性地结合人血红蛋白抗原,而不结合其他物种的血红蛋白(如动物血红蛋白),本法测便潜血不受维生素C、含过氧化物酶的绿叶蔬菜及铁剂等干扰.大便潜血一步检测法是一种快速、灵敏、简便的免疫层析检测法,由于具有高度敏感性和特异性,以及快速直观等优势,对于诊断各种原因引起的上下消化道出血疾病具有重要的定性判别意义.     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人绒毛膜促性腺激素

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法研制用于早孕检测的快速定量层析试纸条。方法:应用EDC/NHS法标记纳米磁珠、Biodot喷膜仪喷点NC膜、双抗体加心法建立免疫层析试纸条、对磁信号进行检测并与ELISA实验做对比,并对结果进行评价。结果:建立了HCG纳米磁性免疫层析试纸条,检测到底线为1miu/ml的HCG抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准;用此方法与商品化免疫胶体金试纸条对临床样本进行检测,检测符合率达99%,与ELISA法比较符合率达100%,且检测时间控制在5min以内。结论:该方法简单快速,灵敏度高,不仅可以应用于HCG的检测,同时为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

以核糖体蛋白L7/L12为分子标志物精准检测肺炎链球菌的研究

目的:以核糖体蛋白L7/L12为标志物,探索一种胶体金免疫层析法快速检测肺炎链球菌的方法。方法:分析核糖体蛋白L7/L12基因序列,构建原核表达载体,表达纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;利用无标记分子相互作用仪检测抗原抗体亲和力;以双抗夹心法研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性及稳定性进行验证分析。结果:筛选得到两株高效分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,两种单克隆抗体均与抗原有高的亲和力并且无竞争,制作的试纸最低检出限为1. 0×105CFU/ml;其与肺炎链球菌有特异性反应,而与其它9种常见呼吸道病原菌均无交叉反应;试纸条在25℃下保存12个月仍具有良好的重复性和稳定性。结论:RP-L7/L12可作为肺炎链球菌的检测标志物,以其单抗制备的胶体金免疫层析试纸可适用于肺炎链球菌的快速检测。     

金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌(土拉菌)的方法,评价其灵敏度、特异性、重复性及其应用。方法:以小鼠抗土拉菌脂多糖单克隆抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜、兔抗土拉菌多克隆抗体作为检测抗体标记胶体金,通过金标银染技术放大检测信号,建立金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌体系;评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;以经荧光定量PCR定量的土拉弗朗西斯菌为检测对象,比较金标银染免疫渗滤法和免疫层析法。结果:金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌的最小检出量为1.0×103 CFU/mL,灵敏度高于免疫层析法;检测大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌、布鲁菌和鼠疫耶尔森菌的结果均为阴性;密封保存的检测卡80 d内重复性良好,100 d后反应强度略有降低。结论:金标银染免疫渗滤法检测土拉弗朗西斯菌敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要仪器设备,可作为快速检测土拉弗朗西斯菌的首选方法。     

心肌型脂肪酸结合蛋白胶体金检测试纸条的制备和初步应用

目的应用胶体金免疫层析法制备检测全血或血清样本中心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的检测试纸条,用于急性心肌梗塞（AMI）的早期辅助诊断。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记鼠抗心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体,喷于玻璃纤维膜上制成胶体金结合物垫,将另一株鼠抗心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和抗鼠二抗分别包被检测线和质控线,组装成试纸条进行灵敏性、特异性、精密性、稳定性及临床样品检测。结果该试纸条的检测灵敏度为10ng／mL,15min内可判定结果;与肌钙蛋白I、C反应蛋白、肌酸激酶、人心肌肌红蛋白无交叉反应。检测240份临床标本,与临床诊断结果进行配对分析,阳性符合率95．83％、阴性符合率100％、总符合率97．92％。结论制备的H-FABP检测试纸条有良好的灵敏性、特异性,可用于早期AMI的辅助诊断。     

基于组合胶体金纳米颗粒的免疫层析试纸条快速可视化检测海产品中副溶血性弧菌

本研究以野生型副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为免疫原制备单克隆抗体,并以组合胶体金纳米粒子(CP-AuNPs)为抗体标记探针,开发了一种基于双抗体夹心原理的可视化快速检测副溶血性弧菌的免疫层析试纸条方法。该方法被应用于梅子鱼、鲜虾、白蛤等海产品中副溶血性弧菌的检测,具有特异性强、检测时间短、灵敏度高的特点,其检测限可达4.77×10³CFU/mL。结果表明该方法可作为海产品中副溶血性弧菌检测的一种有效、快速的诊断工具。     

人肺炎链球菌快速检测胶体金试纸的研制

[目的]研制一种快速检测人肺炎链球菌(S. pneumoniae)的免疫胶体金层析试纸。[方法]对肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)基因序列(Gen Bank:U89711)作生物信息学分析,选取抗原表位强、种内同源性高的片段克隆表达纯化重组蛋白rPspA,并免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;以双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸,并对其特异性、灵敏度以及稳定性进行验证分析。[结果]制备的胶体金试纸对rPspA最低检测限达到0. 1pg/m L,可在15min内完成对肺炎链球菌的检测,与其他10种重要呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃条件下保存6个月仍具有良好的重复性和稳定性。[结论]PspA蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为Sp的检测标志物,以其抗体为基础制备的胶体金免疫层析试纸,适用于Sp菌感染的临床快速检测。     

一种超高灵敏的埃博拉病毒胶体碳侧流免疫层析检测方法的建立

埃博拉出血热 (Ebola hemorrhagic fever, EHF) 由于其高感染性和高致死率特点,快速鉴别诊断并实施隔离是最有效的防止疫情扩散的措施。文中建立了一种可以快速、高灵敏筛查埃博拉病毒 (Ebola virus,EBOV)感染的现场检测技术,用碳纳米颗粒标记抗EBOV基质蛋白VP40兔多克隆抗体,组装成一种可在15 min内检测埃博拉病毒的胶体碳侧流免疫层析试纸条。将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫;以1 mg/mL的抗VP40单克隆抗体 (McAb,4B7F9) 和羊抗兔IgG,按照2 μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上,分别作为检测线与质控线,组装试纸条。该试纸条能够特异地检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP) 和灭活EBOV,而与马尔堡病毒样颗粒 (MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8 (IAV/PR/8)、黄热病毒 (YFV-17D)、登革热病毒2型 (DEN2) 无交叉反应,显示良好的特异性,对1 500份阴性血清进行检测,假阳性率为1.3‰,仅为WHO授权ReEBOV?胶体金试纸的1/100;该胶体碳试纸条检测灭活EBOV的最低检出限为100 ng/mL (相当于106 copies/mL),远优于ReEBOV?胶体金试纸条检出限 (10 μg/mL,相当于108 copies /mL)。热稳定性评价显示试纸条可在室温稳定保存1年以上。文中建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、超高灵敏、特异地检测EBOV,为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。     

Asia1型口蹄疫病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏检测Asia1型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析方法(GICA)。本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体,将该标记物与羊抗豚鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane)上,作为检测带和质控带。经条件优化,组装成检测Asia1型口蹄疫的诊断试纸条。用该试纸条分别对A、O、C和Asia1型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原等87份样品进行了检测,发现该试纸条不与口蹄疫病毒A、O、C型以及猪水泡病病毒抗原发生反应,特异性良好。用该试纸条对口蹄疫细胞毒(TCID50为6.25)的10倍系列稀释液进行了检测,最低可以检测到大约10?4。该试纸条与其他传统诊断方法的符合率为98.8%。初步实验确定该试纸条在4oC下可保存3个月、37oC和室温下大概可保存1周左右。该试纸条是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对现场检测具有一定实用价值。