转基因作物中2种除草剂抗性基因aad1和dmo的PCR检测方法

【背景】抗除草剂转基因作物是全球种植面积最大的一类转基因植物,以除草剂抗性基因作为检测靶标的分子鉴定方法的研究与应用,对转基因生物安全的检测与监测有重要意义。【方法】根据除草剂抗性基因aad1和dmo的核苷酸序列设计PCR检测引物,并进行PCR反应体系优化、方法特异性、灵敏度、再现性等方面的测试,分别建立aad1基因和dmo基因的特异性PCR检测方法。【结果】建立的PCR检测方法在56~64℃的退火温度范围内均能获得一致性结果,具有良好的稳健性。该方法可将含有aad1基因和dmo基因的转基因作物与其他转基因作物区分开,其灵敏度可分别达到20个拷贝和40个拷贝。通过将aad1基因和dmo基因的检测引物放入同一管PCR反应体系中,还能在一次PCR中同时检测这2个靶标基因,双重PCR的检测灵敏度与单一PCR一致。【结论与意义】建立的分子方法可精准检测出含有aad1基因和dmo基因的转基因作物,具有特异性强、灵敏度高的特点,为抗除草剂转基因作物的筛选检测提供了可靠的技术支撑。     

头颈部放疗患者口腔假丝酵母菌感染的快速检测

目的通过对传统培养法和PCR法在假丝酵母菌感染检出率的比较,拟探索一种能够早期、快速、高效检测头颈部放疗患者假丝酵母菌感染的方法。方法收集120名头颈部放疗患者唾液,分别应用假丝酵母菌显色培养基（CHROMagar）进行分离、培养和鉴定;同时提取基因组DNA,通过假丝酵母菌通用引物、特异性引物、改良引物进行PCR扩增,结果与假丝酵母菌表型进行对比。结果与传统培养法相比,PCR法检出率更高（χ2=47.672,P=0.000）;改良特异性引物D扩增的检出率为77%,高于通用引物B（χ2=7.702,P=0.006）和特异性引物C（χ2=12.522,P=0.001）。结论本研究证实PCR技术耗时短,阳性检出率高,可用于头颈部肿瘤放疗患者假丝酵母菌感染的快速检测。     

从粪便样品中检测动物冠状病毒的分子技术研究

目的 感染冠状病毒的动物向环境排毒主要是通过粪便,建立直接从粪便样品对动物冠状病毒进行检测的分子技术具有重要的公共卫生学意义。方法 通过计算机模拟和实验方法对已报道的2对针对冠状病毒pol基因的通用引物的通用性进行了验证。不经传统的病毒分离．直接从环境样品中提取病毒RNA,通过一步法RT-PCR进行检测,并通过分子杂交和Nested PCR扩增结合TaqMan探针实时荧光检测的PCR技术．提高对冠状病毒检测的灵敏度和准确度,并对猪、禽冠状病毒感染的临床样品进行分析检测。结果 2对引物可以覆盖所有已知的冠状病毒,包括SARS,RT-PCR产物通过测序可以确定冠状病毒种类;实时荧光定量NestedPCR有很高的灵敏度,可以灵敏地检出所有供试的阳性样品,而荧光增量实时监测可以排除凝胶电泳检查的假阳性。结论 该研究为从环境中普查和鉴定冠状病毒提供了可靠的技术方法。     

等位基因特异性引物PCR技术及其应用研究

目的：研究建立等位基因特异性引物PCR技术体系,并将其应用于基因单核苷酸多态性研究工作。方法：通过美国国家生物信息中心(NCBI)的genBank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer5．0软件设计引物,并经NCBI的Blast2．0软件检验其特异性。结果：建立了单一等位基因特异性引物PCR(SASP—PCR)与嵌套式等位基因特异性引物PCR(NASP-PCR)两种技术,并应用于β2肾上腺素受体及内皮源性一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性的研究,证实该技术的稳定性和优越性。结论：等位基因特异性引物PCR技术是一种更为简便、特异性较高、费用少的、便于推广的SNP检测方法,特别是在群体基因单核苷酸多态性研究中更有优势。     

分子信标-TaqMan探针法实时荧光定量PCR新型探针及引物

在TaqMan探针法实时荧光定量PCR中,排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题以及由引物二聚体(Primer Dimer,PD)引起的假阴性问题。首先对不同探针进行引物探针聚合实验;然后通过双重PCR的干扰实验选择合适的内标基因,并使用内标质粒检测验证中部同序引物排除PD干扰的实用性;最后比较探针法不同体系检测HBV基因的灵敏度。结果表明,引物与探针聚合实验中,含有反义碱基的HBVP4在重复实验中未出现假阳性;竞争性双重PCR和非竞争性双重PCR两模板开始出现干扰作用的浓度差分别为20倍和100倍;对于内标基因,使用中部同序引物对以及普通引物对分别可以检测到10-9和10-8稀释度;3种HBV基因检测体系,使用普通引物对可以检测到Ct33左右,加入内标系统和使用中部同序引物对均可检测到Ct35左右。在TaqMan-分子信标结构调整的基础上引入反义碱基可以在排除由引物和探针聚合延伸引起的假阳性问题;在探针法中,使用中部同序引物对和加入内标系统均可降低PD的干扰程度,提升检测的灵敏度。     

种特异性PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌研究

阪崎肠杆菌是一种目前认为以奶粉为传播媒介的食源性条件致病菌,通过α-1,4-葡萄糖苷酶基因和ompA基因分别设计引物ESF-ESR和ESSF-ESSR,进行单重和双重PCR方法研究,结果显示所有阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均为阳性,阴性对照均未扩增出目的片段;纯菌单重PCR灵敏度分别为102cfu/mL和101cfu/mL,双重PCR灵敏度为103cfu/mL;在有或无其他细菌存在时,人工污染阪崎肠杆菌模拟样品单重PCR检测灵敏度分别为103cfu/mL和102cfu/mL,双重PCR检测灵敏度为104cfu/mL;实际样品检测显示PCR方法与传统方法具有很好的一致性。结果表明:该PCR方法具有很好的种特异性和灵敏度,能够克服奶粉中杂菌对快速检测阪崎肠杆菌造成的干扰,减少以保守序列来设计引物导致假阳性结果的出现,可以较好地应用于奶粉中阪崎肠杆菌的检测与鉴定。     

双重实时荧光PCR法检测食品和饲料中的鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA细胞色素b基因序列和内参照基因PUC18质粒基因序列设计特异性引物和以不同荧光素标记的TaqMan探针。通过对反应条件的优化筛选,建立能同时扩增鸡源性成分和内参照基因成分的双重实时荧光PCR检测方法。设置内参照反应是为了监控反应体系中是否含有PCR反应的抑制物,避免出现假阴性结果。分别以鸡、鸭、鹅、火鸡、牛、羊、猪、鱼、兔、驴、鹿、狗、马、鸽子、大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯及番茄的线粒体DNA作为模板进行特异性试验,结果表明该方法仅能特异性扩增鸡源性成分,而对其它物种未见有效扩增。通过灵敏度测试,该方法检出限达0.01%。所制定的方法特异性高,灵敏度好,可以作为食品和饲料中鸡源性成分的高效检测方法。     

转基因猪体内外源基因的整合鉴定

外源猪生长激素基因被导入湖北白猪．为避免羊、猪之间在金属硫蛋白启动上的同源性而造成PCR检测结果的假阳性,分别将PCR合成反应的两个引物设计在羊金属硫蛋白基因启动子一侧和猪生长激素一侧,使PCR合成反应的结果特异地反映外源基因的整合性,准确地鉴定出转基因猪．DNA印迹分析结果表明,43头待检仔猪中有6头呈外源基因整合阳性．     

PCR法快速检测肉食品污染沙门菌的实验研究

沙门菌属是引起食源性疾病的重要致病菌之一。传统的检测方法费时、费力,研究建立了检测肉食品中沙门菌的PCR检测方法。根据沙门菌侵袭基因invA设计一对引物,对肉食品中沙门菌基因组DNA进行PCR扩增,建立了沙门菌特异、敏感和快速的PCR检测方法,为食源性致病菌的检测提供参照,在食品检测领域中有良好的应用前景。     

PCR-SSCP分析结合直接测序检测β-地中海贫血患者基因突变型

聚合酶链反应－单链DNA构象多态性（PCR－SSCP）分析适用于DNA多态性分析和基因突变检测．在遗传病诊断及癌基因、抑癌基因等基因突变检测中得到日益广泛的应用［1,2］．我们把PCR－SSCP分析同直接测序结合起来,应用于β-地中海贫血患者基因突变型的检测．同时,对假阳性和假阴性结果出现的频率也作了观察．1材料和方法1．112例卜地中海贫血患者外周血样品,由中国人民解放军第303医院提供,按常规方法提取白细胞DNA［3］l．2PCR按文献介绍的方法进行”’．引物序列：174－ATCACTTAGACCTCACCCTGT（－118——一98）;…     

运用多种策略改良差异显示PCR

目的：改进差异显示PCR技术,提高其在筛选差异表达基因方面的效率。方法：①采用单碱基金铆钉引物;②增加引物长度;③提高PCR反应的严谨性;④应用同步重复测序电泳。结果：减少经典方法的工作量,降低了非特异性和假阳性率。用改良技术研究热适应大鼠下丘脑基因的差异表达,发现了一个差异表达基因片段,斑点杂交证实为阳性片段。结论：改进后的差异显示PCR技术是一种研究基因差异表达从而发现新基因或基因新功能的有效方法。     

PCR对转基因玉米CBH351品系的鉴定检测

成功建立了转基因玉米CBH351（Starlink^TM)的筛选和品系鉴定检测的PCR方法,该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因来检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果,设计检测CaMV35S启动子的引物扩增195bp,来对转基因玉米进行筛选检测;并进一步设计转基因玉米CBH351（StarlinkTM)品系转化质粒图谱中CaMV35S启动子和Cry9C边界位置基因特异性引物扩增170bp,以及目标基因Cry9C的右端与CaMV35S终止子的左端边界位置基因特异性引物扩增171bp,以此来鉴定检测CBH351（StarlinkTM)的品系。     

副溶血弧菌EMA-PCR检测技术的建立

PCR技术被广泛应用于副溶血弧菌的检测中, 但传统的PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌, 往往使检测结果出现较高的假阳性。因此, 将叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与PCR技术结合, 建立一种快速、准确的副溶血弧菌检测方法。以dnaJ基因为检测副溶血弧菌的靶基因, 分别用副溶血弧菌的纯培养细胞及其基因组DNA作模板进行PCR检测, 灵敏度分别为2.5×104 CFU/mL和6×102 fg/μL。在检测样品前处理过程中加入EMA, 当EMA的浓度小于5 mg/L时, EMA对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制; 而终浓度为2 mg/L的EMA, 能有效抑制1×108 CFU/mL副溶血弧菌死菌的扩增。活菌和死菌混合体系的PCR结果表明, EMA-PCR能有效降低副溶血弧菌检测过程中的假阳性。     

添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法

通过构建人工扩增内标,建立可以有效指示沙门氏菌检测过程可能出现假阴性情况的PCR检测方法。本研究基于沙门氏菌invA基因设计特异性引物,复合法构建扩增内标,建立PCR检测体系。特异性引物LW,对33株沙门氏菌和6株非沙门氏菌标准株进行检测,结果显示,所有沙门氏菌均扩增出385 bp的目标片段,非沙门氏菌则只能扩增出484 bp的扩增内标片段,特异性良好。灵敏度实验表明,该检测体系的灵敏度可达6.35 fg/μL。人工污染实验表明,起始染菌量为3.2 CFU/25 mL时,仅需8h增菌培养便可检出。大量食品样品检测证明,该检测体系确实可以有效的避免PCR检测过程出现的假阴性,提高检测准确性。     

猴轮状病毒（SAII）RT—PCR检测方法的建立

上海市实验动物质量监督检验站王胜昌等4位先生根据具有高度保守性编码VP7轮状病毒糖蛋白基因9序列设计引物,分别进行RT—PCR和NT—PCR扩增,结果表明：引物Beg^9／ENd9、Beg^9-1／End9—1及引物RVG9／aET3、RVG9／aET3-1分别能在一次RT—PCR扩增中出现预期的1062bp和3746bp扩增带;引物RVG9／aET3、RVG9／aET3—1在NT—PCR扩增中均能出现预期的374bp扩增带;验证了猴轮状病毒SAII属于血清型3;引物RVG9／aET3进行敏感试验能检测到0．5pg的轮状病毒（SAII）dscDNA。     

鼠伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法的研究

分别根据沙门氏菌16S rRNA、质粒毒力基因spvC、致病基因invB、fimA序列设计4对引物,对沙门氏菌株及非沙门氏株菌基因组DNA进行多重PCR检测。结果该方法能检测出6.3×10² 个cfu/ml纯培养的沙门氏菌,人工染菌食品模拟检测结果显示,熟鸡肉初始含菌量为17cfu/g、全脂奶粉为11cfu/g、生牛肉为13.6cfu/g,经过8h增菌,PCR检测为阳性。该体系能鉴定产生多种毒力因子的沙门氏菌,特异性强、敏感性高,为检测和鉴定沙门氏菌株提供了一个新方法。     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

IMSA技术快速检测沙门氏菌方法的建立及应用

[目的]建立和评价一种快速、准确地检测食品中沙门氏菌的检测方法,对食品安全控制具有重要意义。[方法]应用等温多自配引发扩增技术(Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA),设计筛选出沙门氏菌的特异性基因inv A基因的IMSA引物,并建立检测沙门氏菌的IMSA法。对建立的方法进行特异性和灵敏度试验;确定人工污染样本能被该方法检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;利用IMSA法和培养法对13份食品样本进行检测,评价两者的一致性。[结果]该方法仅对沙门氏菌特异性扩增,灵敏度达3.02×10~2CFU/m L;人工污染样本最短培养6 h可被IMSA法检出,检出限为3.17CFU/25 g; 13份食品样本的IMSA法与培养法结果一致性为100%。[结论]IMSA技术检测沙门氏菌的灵敏度高、特异性强、结果准确,可在7h内完成食品中沙门氏菌的检测,适合用于食品中沙门氏菌的快速检测。     

PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用

本文总结了PCR检测沙门氏菌过程中被检目标基因的选择、引物的特异性以及国内外检测沙门氏菌的一些实例,分析了PCR检测沙门氏菌在引物选择上存在的问题,简述了在传统PCR技术基础上发展起来的检测沙门氏菌新方法。     

沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测

根据沙门菌invA基因、大肠杆菌phoA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因序列,设计3对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果表明3对引物能特异地扩增出284bp、622bp、484bp的目的条带;最佳反应条件为沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的引物浓度分别为40nmol／L、40nmol／L、80nmol／L,Mg^2＋浓度2．4mmol／L,dNTP浓度2001μmol／L,Taq DNA聚合酶1.5u,退火温度55．0℃-57．4℃之间;在此条件下多重PCR同时检测DNA的敏感性分别是10．2pg、10．2pg、102．0pg,检测时间4h。建立的多重PCR是一种敏感、特异、准确、快速的方法,为同时检测食品中沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌奠定了基础。