日本蛇根草花青素还原酶基因的克隆及其生物信息学分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase, ANR)是原花青素合成途径中的关键酶,同时花青素还原酶对植物花色苷的积累也发挥着重要作用。本研究以日本蛇根草为材料,以其转录组测序结果为基础,设计引物通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草ANR基因完整的cDNA序列,利用生物信息学方法和工具对日本蛇根草ANR基因的功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽、二级结构等进行预测和分析。结果表明,该基因cDNA全长为1 020 bp,编码339个氨基酸,预测其蛋白分子量为36.37 kD,等电点为5.92,为亲水蛋白,不含信号肽序列。综上,本研究成功克隆获得日本蛇根草ANR基因并完成其生物信息学分析,研究结果将为解析该基因的功能奠定基础。     

日本蛇根草黄酮醇合成酶基因的克隆及其序列分析

黄酮醇合成酶(FLS)是黄酮醇生物合成途径中的重要调控酶,在黄酮醇生物合成过程中发挥着非常重要的作用。为了更好的认识日本蛇根草黄酮醇合成酶基因的结构特征,本研究以日本蛇根草为研究材料,以其转录组测序结果为基础、通过RT-PCR等方法成功克隆得到日本蛇根草FLS基因的完整c DNA序列,并采用生物信息学方法对日本蛇根草的FLS基因序列进行功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽、二级结构等预测分析。分析结果表明,该基因序列全长1 008 bp,编码335个氨基酸,预测其蛋白分子量为38.342 k D,等电点为5.87,为亲水性蛋白质,不含有信号肽。     

日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1 071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。     

不同植物LDOX/ANS基因的生物信息学分析

花青素是一类重要的植物次生代谢产物。本文采用生物信息学的方法对已在GenBank上登录的拟南芥、西洋梨、苹果、桃、葡萄、芥菜、菊花新品种和水稻等植物的无色花青素双加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS)基因的核酸及氨基酸序列、组成成分、导肽、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等进行预测和推断。结果表明,ORF除了桃和菊花新品种为500bp左右之外,其它几种植物都在1070bp左右,分子量均为4kD左右,理论等电点均低于7,说明LDOX/ANS呈酸性。Glu、Leu和Val是这些植物共有的主要氨基酸。核苷酸同源性比对结果显示,拟南芥LDOX/ANS与其它植物LDOX/ANS的同源性较高;8个物种的LDOX/ANS基因被分为两个大类,单子叶植物水稻LDOX/ANS基因被单独分为一类,其它的均聚成一大类。研究还发现这些植物的LDOX/ANSN端不存在导肽和信号肽,无跨膜结构域,肽链表现为亲水性。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,包含一个20G-FeⅡOxy功能结构域。通过此次研究,希望为今后深入研究该类酶的功能和结构特征提供依据。     

大豆异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆方法获得大豆异戊烯焦磷酸异构酶基因(IPI)的cDNA序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的一般理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行了预测和分析。结果表明,大豆异戊烯焦磷酸异构酶基因的cDNA序列全长1384bp,包含一个906bp的ORF,编码301个氨基酸。大豆IPI酶为一亲水性的非分泌蛋白,α-螺旋和无规则卷曲是其主要的二级结构,该酶定位于叶绿体。     

葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及序列分析

目的:从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用葡萄总RNA为模板,采用RT - PCR技术克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并亚克隆进T- Vector.利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶家族固有的氨基酸保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.结论:该基因的克隆、生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础.     

紫色马铃薯类黄酮3，′5′-羟化酶基因（StF3′5′H）的克隆及分析

类黄酮3′,5′羟-化酶（ flavonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H）是植物花青素生物合成途径中的一个关键酶,紫色土豆（ Solanum tueb or sum） F3′5′H基因的克隆将为花青素合成调控和花青素代谢工程研究提供优质基因资源。研究采用RACE技术克隆了紫色土豆F3′5′H基因的cDNA全长序列,用生物信息学方法对其核苷酸和蛋白质序列进行了分析,并用半定量PCR 技术分析了F3′5′H基因在不同组织中的表达情况,同时研究了赤霉素和蔗糖处理后F3′5′H基因表达与花青素积累之间的相关性。研究结果表明,克隆的紫色土豆F3′5′H的cDNA全长为1854 bp,包含一个1530 bp的完整ORF,共编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,StF3′5′H基因推测编码的氨基酸序列与其它植物的F3′5′H蛋白的相似性很高。 StF3′5′H基因的表达具有组织特异性,在紫色土豆根、茎和叶柄中都有表达,其中在叶柄中表达最强,而在块茎、叶轴和叶片中几乎检测不到StF3′5′H基因的表达。赤霉素和蔗糖能促进紫色土豆StF3′5′H基因的表达,进而促进花青素的积累。     

小鼠脂联素受体2基因编码区的克隆及序列分析

构建小鼠脂联素受体2(mAdipoR2)基因cDNA克隆,并进行序列及基因结构分析,为进一步研究小鼠AdipoR2的表达和生物学活性奠定基础。用RT—PCR方法扩增mAdipoR2基因cDNA,获得的片段连接至pGEM-T载体,转化JM109大肠杆菌,经酶切鉴定后,进行序列测定。利用因特网生物信息学资源分析mAdipoR2基因序列。结果成功地构建了mAdipoR2基因cDNA克隆,其序列与GenBank登录序列一致。通过与小鼠基因组序列比对,分析了mAdipoR2基因结构,其编码序列由7个外显子组成,编码1个含7个跨膜区的膜蛋白,但该受体不属于G蛋白偶联受体家族(GPCRs)。mAdipoR2与人及大鼠蛋白的同源性分别为91％和95％。     

山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析

旨在克隆山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)基因cDNA全序列并进行序列分析.提取山羊睾丸中总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增山羊PHGPx基因cDNA序列并对其生物信息学进行分析.结果表明,山羊PHGPx基因cDNA序列全长844 bp,共编码199个氨基酸;山羊与牛、猪、人和小鼠的氨基酸序列同源性均大于90％;山羊PHGPx蛋白二级结构功能区域属谷胱甘肽过氧化物酶家族,预测23-24和28-29氨基酸位点有潜在的信号肽位点;UPGMA算法构建该物种间分子系统进化树,山羊与牛先聚为一类,再分别与猪、鼠、人、鸡聚类,最后与蜜蜂聚类,与物种动物学分类基本吻合.首次克隆了山羊PHGPx基因,具有GSH-Px家族典型特征,研究结果将为PHGPx基因表达分子调控研究提供一定的理论依据.     

LL-37-haFGF融合蛋白的结构预测与生物信息学分析

目的:为开发一种多功能蛋白分子,该文采用生物信息学方法对LL-37-haFGF融合蛋白进行结构预测与分析.方法:重叠PCR技术克隆LL-37-haFGF基因,运用生物信息学软件分析LL-37-haFGF编码蛋白序列和结构.结果:LL-37-haFGF融合基因编码215个氨基酸,分子量为23.8 kDa,理论等电点为8.86,利于基因工程表达,结构分析表明其结构有利于多功能活性的保持.结论:融合基因的生物信息学分析与结构预测为研究其活性和作用机制奠定了基础.     

普通烟草NtODB基因的电子克隆、表达及生物信息学分析

ODB基因在植物同源重组依赖性的DNA双键断裂修复过程中起重要作用,对植物诱变育种具有潜在的应用价值。克隆烟草NtODB基因并分析其表达特征为丰富ODB基因在同源重组DNA修复过程中的作用提供证据。为得到烟草NtODB基因序列,采用电子克隆技术获得该基因cDNA序列并克隆验证。进一步使用生物信息学方法分析该基因表达特征,对预测蛋白的理化性质、信号肽、高级结构等进行预测。生物信息学分析结果表明,NtODB基因开放阅读框包含579个碱基,蛋白含192个氨基酸残基,NtODB蛋白具有碱性和亲水性,主要定位于细胞质内;实时荧光定量PCR检测结果显示NtODB基因在不同组织中呈现组成型表达特征;亚细胞定位检测提示NtODB主要表达于细胞膜和叶绿体。NtODB基因的克隆与表达分析及其蛋白高级结构和理化性质的预测,可为进一步丰富ODB基因在同源重组依赖的DNA修复系统中的作用机制提供证据。     

RACE法克隆甜菜NR基因及生物信息学分析

硝酸还原酶是氮素代谢的关键酶和限速酶,研究硝酸还原酶的功能对提高甜菜的产量具有重要作用。运用RACE法克隆出甜菜的硝酸还原酶基因,并利用生物信息学对甜菜NR进行主要结构分析和功能预测,并使其在拟南芥中表达,观察根对向重性应答过程中的弯曲情况。结果表〖JP2〗明,利用RACE法克隆得到甜菜NR cDNA全长为2 760 bp;甜菜NR为易溶、亲水性强的蛋白;二级结构预测结果显示,甜菜NR为混合型蛋白;甜菜NR含有钼辅因子、细胞色素b5、FAD及NADH结合域,具有跨膜区域,但不含有信号肽;利用拟南芥突变体观察到野生型比突变体的弯曲较快,暗示甜菜的NR基因可能通过调节NO积〖JP〗累参与植物向重性应答。     

家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表达体系,检测其表达产物的活性,了解家蝇内源性BG酶特点,为进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础。以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透彻的6种代表性昆虫的BG酶基因序列为参照对象,利用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从家蝇cDNA中克隆得到BG酶基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。分别采用原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达体系并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达BG酶基因的融合蛋白。采用七叶苷平板显色法和DNS法检测表达体系融合蛋白的酶活性,并对其性质进行初步的分析。家蝇体内克隆得到了长度为1933 bp的家蝇BG酶基因全长cDNA序列,推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽。重组原核质粒经诱导表达后,在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,证实重组质粒成功表达。重组表达的家蝇BG酶兼具内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蝇BG酶是一种新的多功能纤维素酶,是昆虫纤维素酶研究的重要补充。     

玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆玉米大斑病菌CnB基因,并进行初步的生物信息学分析.[方法]采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,扩增玉米大斑病菌CnB基因全长cDNA序列和DNA序列.运用相关生物信息学软件对该基因序列进行分析和预测其编码蛋白的结构功能.[结果]CnB基因含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为525 bp(GenBank登录号EF 469732),编码174个氨基酸;预测蛋白含约59.77%的α螺旋,8.62%的β转角,6.32%的延伸串,25.29%的不规则卷曲;含有高度保守的4个"EF-hand"Ca2 结合区域,属于Ca2 结合蛋白家族成员,与小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、灰葡萄孢(B.cinerea)、粗糙麦孢霉(Neurospora crassa)等病原真菌中CnB基因有90%以上的氨基酸同源性.[结论]首次在玉米大斑病菌中克隆得到CnB基因,为进一步研究该基因功能奠定基础.     

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略.利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列.然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等.结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp.编码434个氨基酸.预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 Da,与小鼠的同源性为81%.     

梅花鹿PRDX4编码区全长cDNA的克隆及序列分析

过氧化还原酶4(PRDX4)是重要的抗氧化蛋白,在鹿茸角柄骨膜致敏区特异性高表达。为探究其在鹿茸再生中的作用,本研究克隆了梅花鹿PRDX4的cDNA编码区。序列分析表明梅花鹿PRDX4的cDNA编码区长819 bp,编码272个氨基酸,预测该酶分子量3.062 kD,等电点6.1。利用生物信息学软件预测其是一种跨膜蛋白,有一段信号肽序列和两个保守功能域,并对梅花鹿PRDX4蛋白的三级结构进行了预测。     

苦豆子液泡膜Na~+/H~+逆向运输蛋白基因SaNHX1的克隆与生物信息学分析

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)因其具有很强的耐盐、耐旱、耐高温等功能广泛分布于干旱荒漠区。研究报道植物液泡膜Na~+/H~+逆向运输蛋白对植株耐盐性及耐旱性等具有重要作用。本研究首先对苦豆子种子进行萌发处理,采用改良的异硫氰酸胍法提取苦豆子的总RNA,利用逆转录试剂盒获得苦豆子的cDNA,通过同源克隆法获得了苦豆子液泡膜Na~+/H~+逆向运输蛋白基因的cDNA全长,并对其氨基酸序列及可能的功能进行了生物信息学分析。结果显示,所获得的基因编码548个氨基酸,与豆科植物大豆GlNHX1的一致性最高为86%;二级结构预测显示其具有10个跨膜结构,不含信号肽;对其3D结构预测显示该蛋白是一个富含α螺旋的桶装蛋白质。这些预测结果表明本研究所克隆的基因为苦豆子液泡膜逆向运输蛋白Na~+/H~+基因,这将为荒漠植物苦豆子抗逆基因资源的发掘利用奠定基础。     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪(BaMei)肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokinesignaling-2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明:首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列(GenBank登录号为EF121242),其长度为822bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。     

枸杞紫黄质脱环氧化酶(LcVDE)基因的克隆和分析

目的:克隆枸杞VDE基因的全长cDNA,通过对基因序列的生物信息学分析预测表达产物的结构特征和功能位点并验证其功能,为研究枸杞紫黄质循环的作用机理打下基础。方法:利用cDNA末端快速扩增和RT-PCR方法克隆枸杞VDE基因全长cDNA序列,生物软件分析VDE的生物学信息。构建VDE基因的原核表达载体pET-VDE,转化大肠后用IPTG诱导VDE过量表达;并构建体外反应体系对VDE表达蛋白酶功能进行验证。结果:LcVDE基因的ORF长1 413bp,编码的蛋白由470个氨基酸组成,分子量为53.61kDa,等电点为5.77。SDS-PAGE电泳结果表明,枸杞VDE基因在大肠杆菌中得到了过量表达。克隆基因表达蛋白进行紫黄质的脱环氧化反应,吸收光谱和HPLC的分析结果表明,表达蛋白催化了紫黄质的脱环氧化反应。结论:克隆得到的VDE基因编码的蛋白具有紫黄质脱环氧化酶的的功能与活性。