橡胶树白粉菌MAT相关基因(STE2基因)的克隆及表达分析

以橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinm)为材料,根据同源性克隆得到一个MAT相关基因的DNA和c DNA序列,命名为OH-MAT2。生物信息学分析表明,这个基因DNA全长为964 bp,具有一个921 bp的完整开放阅读框(ORF),编码307个氨基酸。其编码的蛋白质分子量为35 584.1,等电点为9.78,且是稳定的疏水性蛋白质。氨基酸序列分析该蛋白质具有STE2家族的保守结构域。结构预测表明该蛋白质主要有α-螺旋、β-折叠及转角构成。相对荧光定量显示该基因在侵染不同时段有表达,且差异明显。     

红色毛癣菌pho88基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)无机磷酸盐转运蛋白(Inorganic phosphate transporter,PHO88)基因,构建原核表达质粒,并对PHO88蛋白进行生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的T. rubrum CBS 118892菌株pho88基因序列(XP-003235348),设计合成特异性引物,提取红色毛癣菌总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增pho88基因,构建到原核表达载体p ET-28a上,测序鉴定其序列,并对其进行生物信息学分析。[结果]红色毛癣菌pho88基因全长582 bp,编码193个氨基酸。PHO88蛋白含有1个跨膜结构域,细胞亚定位为分泌信号途径蛋白,PHO88含有16个磷酸化修饰位点,其二级结构主要由α-螺旋构成,高级结构为全α型蛋白质。[结论]成功克隆红色毛癣菌pho88基因及构建原核表达质粒,为后续PHO88蛋白的诱导表达奠定基础,为后续开发靶向PHO88的抗真菌药物,提供实验基础。     

艰难梭菌细胞毒素B功能区的克隆及序列分析

目的克隆艰难梭菌(Clostridium difficile,C.d)细胞毒素B羧基末端功能区(CDB3)基因,并对其进行测序及生物信息学分析。方法利用PCR技术扩增CDB3基因,并将其定向插入pET-22b( )载体中,以DNA自动分析仪进行序列测定,并以生物信息学软件分析其生物学特性。结果成功克隆了艰难梭菌CDB3基因,经测序表明与GenBank中分布的Clostridium difficile VPI10463的ToxinB3基因序列完全一致。DNAstar软件预测其蛋白质的相对分子量(Mr)约为71.3 kD,并显示出良好的抗原性。结论研究获得了序列正确的CDB3基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

马铃薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及其植物表达载体的构建

目的:克隆马铃薯腺苷酸激酶基因(adk)并进行生物信息学分析,构建反义表达载体。方法:用RT-PCR方法从西南地区马铃薯主推品种“米拉”中克隆adk编码序列,进行生物信息学分析后,反向插入植物高效表达载体pCAMBIA1304 ,构建其反义植物表达载体。结果:克隆到的adk编码序列(stadk)为867bp,编码由288个氨基酸残基构成的多肽。生物信息学分析表明,其亚细胞结构定位于质体,具有典型的腺苷酸激酶蛋白功能域ATP-AMP(Ap5A)结合位点和AMP结合位点,蛋白质三维模型具有典型的ADK蛋白立体结构。该蛋白与另一条来源于马铃薯的ADK2序列的遗传相似性最高,在进化树上与杏、苜蓿、水稻的距离最近,与拟南芥的距离最远。将构建好的反义表达载体pCAMBIA1304 -Astadk导入根癌农杆菌菌株LBA4404,获得了工程菌菌株。结论:克隆到stadk基因。生物信息学分析表明,在淀粉合成水平最高的植物中,腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高。获得的工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物,为实现淀粉代谢工程奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

油菜花粉发育相关基因RALFbn的克隆与表达分析

根据美国NCBI数据库中快速碱化因子(RALF)类基因序列的已知信息,克隆了油菜的快速碱化因子基因RALFbn,对其核酸序列及预测蛋白进行了生物信息学分析,并在油菜多种组织内观测其表达情况.结果表明:(1)经克隆获得油菜RALFbn基因的cDNA序列全长为510 bp,无内含子,编码79个氨基酸.(2)生物信息学分析发现,油菜RALFbn蛋白具有RALF类蛋白保守的“YIXY”区和4个保守的半胱氨酸残基,并且含有N豆蔻酰化位点、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、和酪氨酸激酶磷酸化位点等多个生物活性位点,说明该蛋白在油菜中潜在的生理调节能力较为活跃.(3) RT-PCR检测RALFbn基因在油菜生殖器官中的表达结果发现,RALFbn主要在油菜雄蕊中表达,而在雌蕊、花瓣和萼片中没有表达.提示RALFbn基因极可能与油菜雄蕊中花粉的发育相关.     

牦牛CSRP3基因的克隆及组织表达分析

CSRP3基因(Cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)编码CRP3蛋白,是一个肌发生的正调节因子,可通过多种方式在肌肉发育和肌肉细胞结构维持中起重要作用。通过对牦牛CSRP3基因进行克隆及组织表达谱分析,为后续提高牦牛肉品质的研究提供基础数据。采用RT-PCR方法克隆牦牛CSRP3基因CDS区;再对其进行序列分析及蛋白结构和功能预测等生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在牦牛不同组织中的表达量。牦牛CSRP3基因CDS区长585 bp,编码194个氨基酸;CSRP3基因的系统进化树结果显示,牦牛与黄牛的亲缘性最近,其次是绵羊。牦牛CSRP3基因编码的蛋白为偏碱性不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白,含有磷酸化位点22个,N-糖基化位点2个,O-糖基化位点7个;存在两个LIM结构域,属于LIM结构域蛋白质超家族成员,主要分布于细胞核中;二级结构以无规卷曲为主,三级结构的最佳模型为1b8t.1.A;实时荧光定量PCR结果显示,牦牛CSRP3基因在臀大肌中有较高表达量。生物信息学分析结果显示,CRP3蛋白含有两个LIM结构域,主要分布在细胞核中,实时荧光定量PCR结果显示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有较高表达量,为牦牛CSRP3基因在牦牛肉品质方面的调控机制研究提供了基础数据。     

D-乳酸脱氢酶基因克隆及其表达

构建了一株产D ,L 乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD 1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ1 4 4作为宿主 ,在厌氧条件下通过互补筛选获得乳酸脱氢酶基因 (ldh) ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)检测证明其阳性克隆表现出D 乳酸脱氢酶 (D LDH)活性。核酸序列分析表明 ,ldhD的ORF编码 331个氨基酸残基组成的蛋白质有两个保守区域 ,其中V1 47～D1 76 区是NADH的结合位点 ,R77～E1 0 7区据报道是酶的活性部位。该菌株D LDH和D羟基异己酸脱氢酶 (D HicDH)属于NADH依赖性脱氢酶家族 ,ldhD和其他乳杆菌属的ldhD及D HicDH基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核酸序列相似性最高达 4 9 33% ,氨基酸序列相同性最高为 4 2 % ,是一个新的D 乳酸脱氢酶基因     

发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析

在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定

为了阐明水稻白叶枯病拮抗菌阴沟肠杆菌B8的作用机理,文章采用转座子标签法和染色体步移技术克隆到突变株B8B中Tn5插入位点周边拮抗活性相关片段,并通过基因敲除验证了获得的拮抗相关片段admA’上游调控序列的功能。以转座子中Kan抗性基因为标签,克隆了B8B菌株中Tn5插入位点左侧2 608 bp序列,经两次染色体步移得到Tn5插入位点右侧的2 354 bp序列。序列拼接后获得B8菌株拮抗相关序列4 611 bp的Bcontig。生物信息学分析显示该序列含有7个ORF,分别对应于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)基因的部分编码区、2个LysR家族转录调控因子、弧菌假设蛋白VSWAT3-20465及成团泛菌(Pantoea agglomerans)andrimid生物合成基因簇的admA、admB和部分admC基因序列。B8B菌株Tn5插入分别位于同源于弧菌假设蛋白的anrPORF及‘admA’基因上游200 bp和894 bp处。通过同源重组技术,借助敲除质粒pMB-BG,获得拮抗活性消失的突变株B-1和B-3。结果表明B8B突变株中Tn5的插入可能影响了anrP蛋白的转录和表达,进而调控拮抗物质编码基因簇的生物合成。B8菌株中拮抗物质相关基因是类似于andrimid生物合成基因簇的基因家族,其上游调控区对该抗生素的生物合成具有重要的作用。     

家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析

旨在对家蝇抗真菌肽MAF-1-溶菌酶(LZM)基因进行生物信息学分析,并进行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表达分析。从Gen Bank获得家蝇抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的编码序列,分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR扩增融合蛋白质抗真菌肽-溶菌酶的基因MAF-1-LMZ,将其克隆到原核表达载体p ET-28a中,重组质粒p ET-28a-MAF-1-LMZ在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用IPTG诱导表达,表达产物MAF-1-LMZ通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,采用小试管法倍比稀释法进行活性验证。结果显示,融合蛋白质MAF-1-LMZ序列的ORF为969 bp,编码322个氨基酸残基,理论分子量为35 468.6 Da,等电点为8.31,在大肠杆菌Origmi B/DE3中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。     

杜仲Dirigent蛋白编码基因的克隆及序列分析

分别以杜仲基因组DNA和cDNA为模板克隆DIRs基因,并分析其序列及其蛋白的遗传特性。以杜仲为研究对象,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术获得杜仲DIRs序列,并结合生物信息学方法对杜仲DIRs的序列进行深入分析。从杜仲中克隆DIRs基因序列,利用生物信息手段分析DIRs基因与其它物种的同源性、结构域、功能域、蛋白质理化特性、蛋白质序列跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点以及编码蛋白二级结构等进行分析。克隆的杜仲DIRs片段序列有468bp,不含内含子,编码155个氨基酸。推测的编码蛋白的氨基酸序列与芝麻、五味子同源性最高,分别达71%和70%,具有的5个保守基序,第1～148位之间是个高度保守的结构功能域—Dirigent,为亲水性蛋白,相对分子质量为17kD,理论等电点为4.91,不具有跨膜区;亚细胞定位在细胞质中,不属于分泌蛋白;序列预测具有13个磷酸化位点,未预测到糖基化位点,二级结构主要以无规则卷曲结构组成。以上研究为进一步探讨DIRs基因在木脂素生物合成途径中的功能提供了理论依据。     

山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析

用LongPCR技术克隆山羊 β酪蛋白 (CSN2 )全基因 13.7kb的序列 (GenBank登录号 :AF4 0 90 96 ) .利用PCR RFLP方法鉴定第 14和 192位氨基酸残基相应的核苷酸序列中出现的 2个多态性位点 ,其中第 192位氨基酸残基处的TspRⅠ位点是Saanen奶山羊CSN2基因中新发现的 1个多态性位点 .生物信息学方法分析山羊CSN2基因可见 ,非编码区中的SINE和LINE序列内含多种乳蛋白基因表达调控元件 ,对其基因的顺式表达和转录后调控可能具有重要的作用     

昆虫病原菌(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI克隆及生物信息学分析

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI进行克隆、测序及相关生物信息学分析.序列分析结果显示:IfCHI基因编码区全长为1152bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)D为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二级结构为混合型,蛋白质溶剂可及性主要分为三类,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异.该昆虫病原菌玫烟色棒束孢IfCHI编码基因的成功克隆及生物信息学分析,为进一步研究病原菌CHI基因的遗传特性和表达机制以及为寻找更多的查尔酮类化合物提供了理论基础.     

管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液对黄粉虫过氧化氢酶基因表达的影响

为了探究管氏肿腿蜂Scleroderma guani寄生和注射其毒液对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹中过氧化氢酶表达的影响,采用RT-PCR克隆黄粉虫过氧化氢酶基因,利用生物信息学软件分析基因序列结构特性,采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达特征,使用试剂盒测定过氧化氢酶活性。克隆获得的黄粉虫过氧化氢酶基因编码阅读框序列长1 620 bp,编码539个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列中含有催化氨基酸位点(His-71、Asn-183和Tyr-393)以及过氧化氢酶家族的3个保守基序：近端活性位点序列(FDRERIPERVVHAKGXG)、NADPH结合位点(XXHQXXXXFXD)和血红素配体结合位点(RXFXYXDXH)。被管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液后,黄粉虫蛹中的过氧化氢酶基因的表达量显著上调,其血淋巴和脂肪体中的过氧化氢酶活性显著升高。研究结果表明,管氏肿腿蜂毒液能调控黄粉虫过氧化氢酶基因的表达。     

人Aurora B基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

目的:克隆出人AuroraB基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白.方法:利用TRIzol Reagent 法提取食管癌ECa 109细胞总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增Aurora B基因,构建pET 28a(+)-Aurora B重组质粒,将其转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG体外诱导表达重组蛋白.利用生物信息学工具对Aurora B的核酸序列和蛋白功能结构进行分析.结果:成功构建了pET 28a(+)-AuroraB重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人Aurora B基因序列同源性达到了99％;获得AuroraB蛋白,大小约39kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的28％.结论:对人AuroraB基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,为深入研究Aurora B在细胞周期调控中的作用机制及后续Aurora B抑制剂的体外筛选奠定基础.     

稻瘟病菌MGG_14095基因克隆、表达及其表达产物的纯化

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzoe)是世界上危害性最大的水稻病原菌,也是阐明植物真菌病分子基础的主要模式生物,开展稻瘟病菌生长发育的相关研究,对稻瘟病的防治有重要意义.MGG_14095基因是稻瘟病菌的致病基因,对MGG_14095蛋白进行生物信息学预测,结果显示,MGG_14095蛋白等电点(pI)为5.72,不稳定指数为50.99,属于酸性不稳定蛋白;含角质酶保守结构域,隶属α/β水解酶超家族;有明显跨膜结构和信号肽剪切位点,属于分泌型蛋白质.本研究克隆稻瘟病菌MGG_14095(38-281)基因,构建原核表达系统pETM20-MGG_14095(38-281),采用分步层析纯化MGG_14095(38-281)蛋白,成功获得高纯度可溶目标蛋白.本研究结果为解析MGG_14095(38-281)蛋白质结构、探索稻瘟病菌致病机理及对稻瘟病菌防治提供一定的理论与试验依据.     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆与生物信息学分析

根据已报道的植物鲨烯环氧酶(SE)基因特异性引物克隆竹节参SE基因.结果表明,克隆得到竹节参SE全长为1 632 bp,编码539个氨基酸,命名为PjSE.生物信息学分析指出,PjSE基因的氨基酸序列与人参属植物人参、三七、越南人参的同源性依次为99％、98％和98％.推测PjSE基因定位于线粒体(mTP)、叶绿体(cTP)和分泌途径(SP).PjSE基因存在保守结构域FAD结合位点,含4个跨膜结构域和7个motif结构位点.PjSE蛋白二级结构以无规则卷曲(Random coli)和α-螺旋(Alpha helix)为主要结构元件,延伸链(Extended strand)和β转角(Beta turn)分散于整个蛋白质中,百分比依次占40.82％、37.48％、15.77％、5.94％;该蛋白能折叠形成典型的三维结构.     

东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究

东方肉座菌EU7-22具有高产半纤维素酶的能力。根据已报道的同属里氏木霉及绿色木霉木聚糖酶,木糖苷酶相关基因序列,设计PCR引物扩增出东方肉座菌内切木聚糖酶(XYNⅠ,XYNⅡ)及β-木糖苷酶(β-BXL)基因。序列经NCBIBlast分析:东方肉座菌xynⅠ基因与里氏木霉xyn1基因(X69573.1)的同源性最高达到91%;xynⅡ基因与绿色木霉xyn2基因(EF079061)同源性最高达到93%;β-bxl基因与里氏木霉β-bxl1基因(Z69257.1)的同源性最高达到94%。生物信息学分析表明内切木聚糖酶Ⅰ和Ⅱ均属于糖基水解酶家族11,N末端前19个氨基酸均为信号肽。内切木聚糖酶Ⅰ分子量为24.13kD,等电点为7.87,含有3个糖基化位点;内切木聚糖酶Ⅱ分子量为24.44kD,等电点为4.86,含有1个糖基化位点;β-木糖苷酶属于糖基水解酶家族3,分子量为87.27kD,等电点为5.49,N末端前20个氨基酸为信号肽,含有8个糖基化位点。利用SWISS-Model对木聚糖酶,木糖苷酶蛋白质三级结构进行了预测和模拟。对木聚糖酶和木糖苷酶基因及其编码蛋白质的生物信息学分析,为进一步研究这些基因的表达与调控、构建高效利用纤维素组份的工程菌株奠定基础。