发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析

在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。     

发菜固氮基因nifD和nifK克隆及其失水条件下的差异表达

nifD和nifK编码钼铁固氮酶中的钼铁蛋白。为了解发菜nifD和nifK分子信息及对水分胁迫的响应机制,该研究设计了简并性引物克隆发菜nifD和nifK全长,进行原核表达和生物信息学分析,并对不同失水状态下发菜nifD和nifK在转录水平的差异表达和固氮酶活性的变化进行分析。结果表明,发菜nifD和nifK全长分别为1 443 bp和1 536 bp (登陆号为分别为KU886164和KU886165);将nifD和nifK在大肠杆菌中表达,分别获得一个约57 kD和58 kD的外源蛋白;生物信息学分析表明,nifD和nifK核苷酸序列和推译的氨基酸序列均与点形念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)高度一致性;nifD和nifK的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和随机卷曲。此外,随着藻体含水量的逐渐降低,发菜nifD和nifK在转录水平上的表达量逐渐增加,但固氮酶活性呈现先增加后下降的趋势。研究结果为深入全面研究发菜固氮酶基因结构及其响应水分胁迫的固氮机理及氮代谢途径提供了基础。     

不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定

采用液氮研磨与超声波破碎相结合的方法,破碎不同失水状态的发菜藻体和细胞,用差速离心法制备发菜类囊体膜粗制品,蔗糖密度梯度高速离心纯化类囊体膜,SDS-PAGE电泳分离类囊体膜蛋白,并对膜蛋白进行了MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析和鉴定。结果表明:(1)充分吸胀4h后失水6h的发菜(含水量51.2%)和失水24h的发菜(含水量14.9%),经过多步差速离心后再进行蔗糖密度梯度高速离心,可得到纯化的类囊体膜。(2)发菜类囊体膜蛋白SDS-PAGE电泳分离到14个条带,共鉴定出8种蛋白,根据其功能可分为4类——光合作用相关蛋白(光系统Ⅱ锰稳定蛋白PsbO,F1F0 ATP合成酶α亚基和β亚基)、结构域蛋白、选择性通道蛋白OprB、未知蛋白(hypothetical protein Npun_R1321、Npun_R3785、N9414_02186),它们在发菜的光合作用中具有重要作用。