转座子Tn917插入位点侧翼序列的扩增

为了克隆到生防菌株的抗病基因,以一株对灰葡萄孢菌表现很高拮抗活性的蜡样芽孢杆菌B-02菌株为材料,利用转座子标签技术得到拮抗性消失的突变体,进而利用TAIL-PCR技术扩增出Tn917插入位点两侧的未知序列,利用生物信息学分析扩增序列,为进一步研究该基因片段与菌株拮抗性之间的关系奠定了基础。     

转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位

用含Tn5转座子的质粒pRL1063a诱变苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,得到盐敏感突变株042BML-2。采用转座子挽救法对Tn5插入位点两边的序列进行克隆与测序,获得了1179bp的转座子插入位点侧翼DNA序列。在GenBank中进行序列同源性和基因定位分析,结果表明：转座子插入在一个功能未知的基因内部,此基因长6270bp。研究证明：该基因与042BM的耐盐性有关,并定名为rtsC。氨基酸疏水性分析表明,在RtsC蛋白的N端有两个跨膜区,该蛋白与细菌趋化性相关蛋白的功能域有同源性。并对RtsC蛋白在苜蓿中华根瘤菌042BM耐盐性中的作用进行了讨论。     

荧光假单胞菌Tn5转座诱变及对青枯病生防特性

目的：利用Tn5转座诱变荧光假单胞菌PF20001,研究所获得的突变株对青枯病的生防效果。方法：利用三亲本杂交方式,将带有转座子Tn5的Tn5-102（含luxAB）的质粒pTR102成功地转入PF20001,利用平板相互拮抗法分析突变株对青枯病致病菌的拮抗作用。结果：通过诱导Tn5转座,得到荧光假单胞菌PF20001的Tn5插入突变库。经平板相互拮抗实验发现,菌株PF20001-lux-48拮抗圈明显大于野生型（半径达0.35cm）。用Tn5-lux特异引物进行PCR扩增,结果显示只有以该突变株的DNA为模板才能得到300bp的扩增产物,证实该菌株基因组中有Tn5插入。结论：Tn5的插入使菌株PF20001对青枯病生物防治能力增强。     

卡西霉素生物合成基因簇中调控基因calR1的功能

【背景】卡西霉素(calcimycin)是重要的离子载体抗生素,其生物合成基因簇已从教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA中成功克隆,但基因簇内的部分生物合成基因及调控基因的功能有待研究。【目的】研究卡西霉素产生菌教酒链霉菌NRRL3882中编码TylR家族同源转录调控蛋白的calR1基因的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法,构建calR1基因敲除突变株及回补菌株,对突变菌株及回补菌株进行发酵,通过HPLC分析其代谢产物。利用荧光定量PCR检测ΔcalR1突变菌株和野生菌株的生物合成基因转录水平。【结果】calR1基因敲除突变株丧失产生卡西霉素的能力,但仍有中间产物噻唑霉素的积累,回补菌株中卡西霉素的产量有一定程度的恢复。RT-qPCR结果表明,卡西霉素合成相关的一些重要基因calC、calG、calU3等基因的表达量明显改变。【结论】TylR家族转录调控基因calR1是卡西霉素生物合成的调控基因。     

不同碳源对生防荧光假单胞菌2P24产抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的影响

【目的】包括碳源代谢等不同环境因子可调控生防菌株生防相关因子表达,进而影响其防病效果。荧光假单胞菌2P24可防治多种植物病原真菌、细菌引起的土传病害,抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphoroglucinol,2,4-DAPG)是其主要生防因子之一。本文利用平板对峙法及遗传学方法研究不同碳源对菌株2P24产生2,4-DAPG的影响及相关的调控途径。【方法】利用平板对峙法检测了菌株2P24在添加葡萄糖、果糖和蔗糖等碳源的土豆浸液培养基中对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的拮抗能力及菌株2P24中影响2,4-DAPG产生的相关基因的表达。另外,利用Tn5转座子对含有2,4-DAPG合成基因phl A报告质粒p970Gm-phl Ap的野生型菌株2P24进行随机突变,在果糖土豆浸液培养基中筛选提高phl A基因表达的突变菌株。【结果】平板对峙实验表明,菌株2P24以葡萄糖为碳源时其抑菌活性最强,蔗糖次之,而以果糖等为碳源时菌株2P24无抑菌活性;转录融合实验进一步表明葡萄糖可促进phl A基因的表达,果糖则不影响phl A基因的表达。在果糖土豆浸液培养基中,转座子随机突变实验获得了5株可明显提高phl A基因表达的突变菌株。Tn5插入位点和序列分析显示其中一个突变体是Tn5破坏了che B基因。转录检测表明与野生菌株相比,che B突变体中phl A基因的表达和2,4-DAPG的前体物质间苯三酚(phloroglucinol,PG)产量都显著提高。游动性实验发现突变che B基因可显著降低该菌株的游动性。【结论】上述结果表明菌株2P24中不同碳源在转录水平上可影响phl A基因的表达,进而影响2,4-DAPG产生。遗传学结果也显示,che B基因参与调控2,4-DAPG生物合成过程。     

食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌生物合成突变株的筛选和鉴定

目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因。方法:构建食甲基杆菌J1-1 Tn5转座突变体库,筛选PQQ合成水平差异明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变基因,通过基因敲除、回补及过表达进一步研究该基因与PQQ合成的关系。结果:构建了J1-1的Tn5转座突变体库,筛选得到一株PQQ合成水平显著下降的突变株,经鉴定Tn5插入位点为mpq0056基因,该突变株在以甲醇为惟一碳源的培养基中生长速度略慢;敲除J1-1中mpq0056基因后,PQQ的合成水平下降,与Tn5诱变结果一致;回补该基因后,PQQ产量恢复到野生菌水平。结论:mpq0056基因参与了PQQ的生物合成,该基因可能编码分支酸盐裂合酶,并在PQQ生物合成中起重要作用。     

荧光假单胞菌2P24中opgGH基因影响抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚的产生

【目的】抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)是生防菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 2P24防治植物病害的关键因子,然而对2,4-DAPG生物合成的调控通路并未完全解析。【方法】前期利用Tn5随机突变的方法获得一株对棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)拮抗能力完全丧失的突变菌株W3,本研究利用基因互补等方法研究该突变体中被破坏的基因对菌株2P24分泌2,4-DAPG和其他生防相关性状的影响。【结果】Tn5插入位点及其序列分析表明突变菌株W3中Tn5破坏了opgG基因。鉴于opgG和opgH基因组成操纵子,利用同源重组技术构建了opgGH内缺失突变菌株。与野生菌株2P24相比,opgGH突变菌株中2,4-DAPG的产量显著降低。对其他生防相关性状的检测发现,突变opgGH基因并不影响群体感应系统(quorum sensing,QS)信号分子的产生、氢氰酸的产生以及生物膜的形成,但可抑制菌株2P24的游动性。转录融合实验进一步表明opgGH基因并不调控gacA基因及其调控...     

铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因的筛选与鉴定

【目的】研究铜绿假单胞菌弹性蛋白水解能力相关基因。【方法】应用人工Mu转座技术构建铜绿假单胞菌野生型菌株PA68的转座突变文库,从2000多个突变子中筛选得到4株弹性蛋白水解能力改变的突变子,并通过克隆及测序获得转座子插入位点侧翼的序列。将铜绿假单胞菌弹性蛋白酶结构基因lasB的转录启始区序列整合入载体pDN19lacΩ并将该重组质粒电转化入野生型菌株PA68及4个突变株中,对报告基因在不同菌株中的表达水平进行测定。【结果】发现4个突变株中Mu转座子分别插入lasA、galU、xcpZ和ptsP 4个基因。ptsP基因失活的突变株中,lasB基因的转录水平是野生型菌株的7%,xcpZ和lasA基因的失活使lasB基因的转录水平分别降低为野生株的54%和75%,galU基因的插入失活使lasB基因的转录上升了1倍。【结论】推测ptsP和galU基因很可能直接或间接地调控着弹性蛋白酶的生物合成。     

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。     

活性污泥微生物解壳聚糖松江菌中菌胶团形成相关大型基因簇的鉴定和分析

【背景】活性污泥法已广泛应用于城市污水和工业废水的处理,微生物菌胶团的形成在污泥通过重力沉淀实现泥水分离和污泥回用的过程中起着重要作用。从西安北石桥污水处理厂活性污泥中分离到一株菌胶团形成菌XHY-A6,经鉴定为解壳聚糖松江菌(Mitsuariachitosanitabida)。【目的】旨在揭示该株解壳聚糖松江菌菌胶团形成相关的基因及其菌胶团形成机制。【方法】结合分子遗传学,包括转座子插入突变技术和遗传互补分析以及基因组学方法分析与菌胶团形成相关的基因和基因簇。【结果】通过转座子插入突变技术获得了两株菌胶团形成缺陷的突变株,转座子插入位点在糖基转移酶(称为gt3)和多糖链长决定蛋白(wzz)基因内,且这两个基因位于一个与菌胶团形成相关的大型基因簇内,该基因簇内还包括与胞外多糖生物合成和分泌相关的基因、epsB2-prsK-psrR-prsT基因以及一个编码PEP-CTERM蛋白A的基因,遗传互补分析证明gt3基因、wzz基因及其下游wzc基因在菌胶团形成过程中是必需的。【结论】松江菌中菌胶团形成和调控机制极可能与活性污泥优势菌动胶菌(Zoogloea)非常相似,即由胞外多糖和PEP-CTERM家族胞外蛋白质共同介导。从武汉二郎庙、汤逊湖和深圳南山污水处理厂活性污泥中分离纯化出松江菌,这些松江菌属细菌可以用于富含几丁质和壳聚糖的市政污水和虾蟹类食品加工废水的净化和资源化利用。     

霍乱弧菌中调控aphB 的基因筛选及其功能

【目的】筛选霍乱弧菌C6706-中调控LysR家族蛋白AphB表达的基因。【方法】将霍乱弧菌埃尔托型菌株C6706-aphB启动子区克隆到2个报告质粒pBBRLux和pKP302上,并将其导入霍乱弧菌C6706-中,以此作为出发菌株。利用出发菌株与转座子pSC123接合构建LZV630-302转座子随机突变文库,通过测定化学发光强度检测aphB启动子的表达水平,筛选aphB表达受影响的突变株。利用随机PCR方法检测转座子插入位点,并测序比对分析基因。【结果】从7个转座子库中(共约4万个突变株)得到能影响aphB表达(均导致下降)的2株突变株T1和T2。测序比对发现T1中转座子插入在vc1585读码框内,T2中转座子插入在距vc1602基因末端7 bp处。【结论】获得aphB表达改变的突变株,基因vc1585和vc1602可能直接或间接影响aphB表达,为进一步研究aphB表达调控影响因素奠定了基础。     

转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析

为寻找谷氨酸棒杆菌转座子插入突变菌株中的转座子插入位点,采用了转座子挽救法对转座子及其插入位点附近的序列进行分离,并测定插入位点相邻DNA序列,获得了三个转座子插入位点DNA序列,其中一个是柠檬酸合成酶基因,另两个为目前未知基因,暂命名为orfA和orfB。该方法简便易行,是分析转座子插入位点的理想方法。     

利用Tn51063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BMnoeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn51063（含luxAB）的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和 042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn51063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

PNP降解相关基因温敏突变株的分离及其特性研究

通过接合转移将质粒pSC123上的转座子Tn5随机插入到DLL-E4基因组DNA中,从大约8,000个突变株中得到1株温度敏感型突变株MT54。根据转座子上的已知序列设计引物以MT54基因组DNA为模板进行PCR扩增,证实MT54的染色体中有转座子插入。MT54在30℃条件下能够以对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)为唯一碳源生长,但在37℃不能生长。格里斯试色剂法检测NO_2~-的生成情况进一步证明了MT54的这种特性。通过30℃和37℃两种温度条件下MT54和原始出发菌株DLL-E4对PNP和对苯二酚降解情况的比较,推测温敏突变位点可能发生在与PNP降解相关的基因中。     

卡西霉素生物合成调控基因calR2的功能

【背景】卡西霉素(Calcimycin)是由教酒链霉菌NRRL3882产生的吡咯聚醚类抗生素,结构独特且具有广泛的生物活性,但其生物合成调控机制尚不清楚。【目的】研究卡西霉素生物合成基因簇上编码LuxR家族同源蛋白的潜在调控基因calR2的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法对卡西霉素基因簇上的calR2基因进行中断,HPLC对突变株及回补菌株的代谢产物进行分析。利用荧光定量RT-PCR分析ΔcalR2突变菌株和野生菌株的基因转录水平差异。【结果】calR2基因中断的突变株不能产生卡西霉素,回补菌株则恢复产生卡西霉素的能力。RT-PCR结果表明卡西霉素生物合成的一些重要骨架基因在ΔcalR2突变株中的转录水平明显降低。【结论】LuxR家族转录调控基因calR2在卡西霉素生物合成过程中起正调控作用。     

利用Tn5-1063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BM noeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn5-1063(含luxAB)的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meldoti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

Streptomyces lincolnensis新遗传操作方法的建立以及lmbQ基因功能研究

以载体pSET152和pKC1139为出发质粒,通过供体菌大肠杆菌ET12567和S17-1转入林可链霉菌 (Streptomyces lincolnensis),建立和优化了接合转移体系.林可霉素生物合成基因簇中,lmbQ基因可能编码一个调控蛋白,构建了S.lincolnensis lmbQ基因中断载体,通过接合转移导入S.lincolnensis野生型菌株,筛选得到基因双交换突变株,通过PCR以及测序验证基因型正确,该突变株即为lmbQ同框敲除突变株.摇瓶发酵结果表明,lmbQ基因是一个正调控基因.     

Tn5介导的致病性副溶血弧菌溶血能力差异突变株表型分析

【目的】构建致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)突变体库,分析溶血能力差异突变株表型特征,为深入挖掘和认识tdh的调控机制提供研究基础。【方法】利用双亲本接合法,将Mini-Tn5-Km2片段随机插入致病性Vp (ATCC 33846)基因组,并以含有卡那霉素(Km)和氨苄青霉素(Amp)的TCBS选择性培养基进行突变株(KmRAmpS)筛选;结合PCR方法对突变菌株进行Km基因筛查,构建在不同基因位点随机插入突变的Vp突变体库。以我妻氏血平板筛选溶血表型变化菌株,并对其生长曲线、菌膜形成能力和运动能力进行测定。【结果】采用双亲本接合法,成功建立包含490株Vp突变株的突变体库,并获得5株溶血表型变化稳定的菌株(2株为溶血能力上调,3株为下调)。5株突变株在生长速率、菌膜形成能力及运动能力方面与亲本株有显著性差异。其中,2株溶血能力上调菌株及1株溶血能力下调菌株在运动能力、生长速率和菌膜形成能力方面较亲本株显著降低(P<0.05);另2株溶血能力下调菌株菌膜形成能力较亲本株显著提高(P<0.05)。【结论】Tn5转座子可用于建立Vp突变体库;Vp溶血能力与其表型特征具有相关性;研究所获得的5株溶血表型突变株为进一步探讨Vp tdh的调控机制奠定基础。     

利用TAIL-PCR克隆耐盐基因及其分析

通过大量筛选得到一株高耐盐的豇豆根瘤菌WME7,最高可耐15g/L NaCl,利用Tn5-sacB转座子对该菌株进行随机插入突变,从突变子中筛选获得30个共生缺陷型突变株。利用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)方法克隆了突变株Tn5-sacB侧翼序列,通过BLAST发现有1个突变株的插入失活基因与鼠伤寒沙门氏菌抗银的结合蛋白SilE有94%同源性,表明有关Na+离子的抗性基因可能与Ag+离子的抗性基因有某种关系。该基因在其它菌中也能抗其它金属离子(铜、锌、钴、铬)。     

鱼腥藻PCC7120基因组中一个影响异形胞发育和图式形成的新区域

以Tn5 10 87b诱变鱼腥藻PCC712 0 ,筛选不能利用氮气生长、异形胞图式发生变化的突变株。突变株 # 180 1经缺氮诱导 2 4h后无异形胞形成 ,48h后沿藻丝形成少量成熟异形胞 ,占藻细胞总数比例为 2 .8% ,其异形胞发育速度和形成频率均与野生型有显著区别。以ClaⅠ酶切该突变株总DNA、自环化后以电泳冲法转化大肠杆菌 ,回收带有插入位点两侧DNA片段的转座子Tn5 10 87b。经测序确定转座子位于未知功能基因alr0 0 99第 14 8和 14 9碱基之间。为证明突变性状确由alr0 0 99内的插入突变引起而不是由于其他二次突变 ,通过同源双交换将含新霉素抗性基因的C .K2片段定向插入基因组中alr0 0 99的EcoRV位点 ,获得重构的鱼腥藻突变株DR2 14 ,其表型与原突变株 # 180 1相同。以上结果表明alr0 0 99或其下游基因是鱼腥藻PCC712 0基因组中与异形胞发育和图式形成相关的一个新区域。