埃兹蛋白(Ezrin)及其突变体的原核表达与纯化

Thr567位点磷酸化是ezrin活化的必需条件。利用定点突变引物将T567突变为A或D,通过PCR扩增出相应的基因片段,将其通过T4连接酶连接至含His标签的原核表达载体pET-20b(+),构建了原核重组质粒pET-20b(+)-Ez WT,pET-20b(+)-EzT567A和pET-20b(+)-EzT567D。转化表达宿主大肠杆菌Rosseta后,用异丙基-β-硫代半乳糖诱导重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和镍柱纯化以后,应用western blot鉴定纯化的融合蛋白。Ezrin野生型及其组成型激活和显性负突变质粒的成功构建及其目的蛋白His-Ez WT,His-EzT576A和His-EzT576D的成功表达纯化,为更深入地研究ezrin生物学功能奠定基础。     

Nmp4促进TNF-α诱导的成骨细胞凋亡

核基质蛋白4(nuclear matrix protein4,Nmp4)是一种具有核质穿梭功能的结构性转录因子.主要通过负调控调节成骨细胞分化和增殖,抑制骨密度及骨量增加,而Nmp4是否调节成骨细胞凋亡,还未有相关报道.本课题通过分离Nmp4基因敲除(Nmp4-KO)和野生型(WT)小鼠原代成骨细胞,以肿瘤坏死因子(TNF-α)为凋亡诱导手段,研究了Nmp4对成骨细胞凋亡的影响及其作用机制.体外细胞实验发现,Nmp4-KO显著抑制TNF-α诱导的成骨细胞内caspase-3激活.Nmp4-KO促进细胞外信号调节激酶(Erk)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号途径的激活,抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化,从而对抗成骨细胞凋亡.TNF-α诱导处理可增强成骨细胞核因子NFκB磷酸化及其核转位,但Nmp4基因缺失无进一步促进作用.未经诱导处理的Nmp4-KO细胞内NFκB磷酸化水平显著高于WT对照.此外,TNF-α诱导处理促使线粒体途径信号分子Bad磷酸化及Bcl-xl表达水平适当升高,但在两种细胞表型间无显著差异.这些结果证实,Nmp4基因敲除可促进相关抗凋亡信号分子的激活和表达,抑制促凋亡信号的激活,进而抑制成骨细胞凋亡的发生.     

雌激素受体α磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测

目的:构建雌激素受体α(ERα)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法:以pc DNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pc DNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变。结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103。在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱。     

PTEN基因诱导人胚肾293细胞凋亡和细胞周期停滞

为了研究抑癌基因PTEN过表达对HEK293细胞凋亡和细胞周期停滞的作用,以野生型PTEN和PTEN突变子(T910G)表达质粒分别转染无PTEN表达的人胚肾293细胞,采用细胞质梯度DNA方法检测细胞凋亡,以流式细胞仪分析细胞周期.发现PTEN过表达能够诱导人胚肾293细胞质中出现梯度DNA,293细胞发生凋亡,PTEN过表达改变细胞周期分布,G0/G1期细胞增加13%,S期细胞下降15%.PTEN突变子对细胞凋亡和G1细胞停滞的影响略弱于野生型PTEN.PTEN基因过表达明显下调血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的蛋白激酶B(PKB)和p42,p44-促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化水平,PTEN突变子对p42,p44-MAPK磷酸化水平的调节作用略弱于野生型PTEN.PTEN通过抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡而影响细胞生长.     

PA28γ及其胞浆定位突变体的构建及在肝癌细胞HepG2中的表达

目的：野生型PA28γ和核定位序列突变的PA28γ真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HepG2中的表达,为进一步研究PA28γ的功能提供实验基础。方法：采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γ cDNA开放阅读框全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中,在该载体中利用定点突变获得核定位序列缺失的克隆。分别将野生型（WT）和突变型（MT）PA28γ克隆克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中,脂质体法转染293T细胞确定两种克隆的细胞定位。再将野生型和突变型PA28γ分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)Flag中,构建好的真核表达质粒采用脂质体法转染人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选、Western Blot鉴定后,获得分别高表达野生型PA28γWT和PA28γMT的HepG2细胞系。结果：双酶切及DNA测序结果表明,成功克隆和构建了含PA28γWT和PA28γMT的pDsRed1-C3和pcDNA3.1(-)Flag重组质粒;荧光显微镜观察证实在293T细胞中pDsRed1-C3/PA28γWT定位在胞核中而pDsRed1-C3/PA28γMT定位在胞浆中;Western Blot检测HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γWT和HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γMT,证实所筛选的HepG2细胞高表达相应目标蛋白。结论：成功构建了高表达野生型PA28γ和胞浆定位PA28γ的HepG2细胞系,为进一步研究人类PA28γ基因的功能奠定了基础。     

大肠杆菌中透膜小肽抑制α-Synuclein聚集的研究

目的:在大肠杆菌中研究透膜小肽抑制α-Synuclein(A53T,S129A,WT)的异常聚集.方法:基于α-Syn核心区的疏水区域设计了5种包含7个精氨酸的多聚精氨酸多肽膜透过传输系统的小肽R7P1～R7P5;构建融合蛋白α-Syn-GFP,其中α-Syn基因融合于GFP上游,透膜小肽以双顺反子方式与α-Syn-GFP共表达;以文献报道的可抑制α-Syn异常聚集的小肽ASI1D(MRRGGAVVTG(R)6)为对照,通过监测整体细胞荧光强度研究透膜小肽影响α-Syn(A53T,S129A,WT)的异常聚集的情况.结果:5种小肽能不同程度的抑制α-Syn(A53T,S129A,WT)的异常聚集;和对照Pc相比,R7P4抑制α-Syn(A53T)异常聚集的效果提高了55%,R7P3抑制α-Syn(S129A)异常聚集的效果提高了64%,R7P4抑制α-Syn(WT)异常聚集的效果提高了39%.结论:在大肠杆菌中,透膜小肽可以有效地抑制α-Syn(A53T,S129A,WT)的异常聚集.     

PLDα1介导ABA调控的拟南芥主根伸长并参与根毛生长

探讨了磷脂酶Dα1（PLDα1）在ABA抑制拟南芥主根伸长过程中的作用。PLOα1基因突变体pldα1主根伸长受ABA抑制小于野生型（WT）;根系PLDα1活性在ABA处理下升高;拟南芥根细胞原生质体中活性氧（ROS）含量在ABA处理下升高,但是pldα1升高小于WT;根系NADPH氧化酶活性在ABA处理下升高,pldα1升高小于WT,外源加入10μmol/L^-1 PA（磷脂酸,PLD水解产物）后,前者活性显著升高;外源加入H2O2可诱导WT和pldα1主根伸长都受到抑制,且二者差异不明显。结果表明,PLDα1产生的PA通过激活NADPH氧化酶产生ROS介导ABA调控的拟南芥主根伸长过程。此外,初步探讨了PLDα1在拟南芥根毛尖端生长中的作用：pldα1突变体根毛长度小于WT,根毛尖端ROS和Ca^2＋浓度低于WT。     

BAD与JNK协同调节UV诱导的细胞凋亡

JNK和BAD(bcl-2相关死亡启动子)都是参与细胞凋亡的重要调控蛋白. 然而,二者在功能上的联系及其在细胞凋亡中的相互作用尚未见报导. 本研究证明, BAD可作为JNK的磷酸化底物, 与JNK相互作用, 协同调节紫外线（UV）诱导的细胞凋亡. 蛋白质印迹检测PARP (聚ADP核糖聚合酶)裂解, 以及流式细胞术检测细胞凋亡结果揭示, UV诱导的MEF细胞凋亡依赖JNK的激酶活性. siRNA敲降BAD的蛋白表达,可增加MEF细胞对UV 诱导的细胞凋亡的敏感性. UV处理的野生型MEF细胞抽提液（含JNK激酶活性）可催化GST-BAD底物发生磷酸化修饰, 而UV未处理的细胞抽提液却不能. 结果提示, UV激活的JNK活性可催化BAD磷酸化|体外合成的持续活化的JNK与GST-BAD体外共孵育结合质谱分析证明, JNK 可催化BAD蛋白的Thr-201磷酸化. 提示BAD是JNK的底物. 此外,野生型和T201A突变的BAD质粒转染BAD-/-细胞结果显示, BAD的T201磷酸化可抑制JNK激酶活性及其底物c-Jun的磷酸化, 提示BAD磷酸化对JNK具有负反馈调节作用. 上述结果证明,BAD作为底物可被UV激活的JNK激酶磷酸化|磷酸化BAD反过来又可抑制JNK的激酶活性, 负性调节细胞凋亡. 综上所述, BAD与JNK能够相互影响, 协同调控UV诱导的细胞凋亡.     

拟南芥中H_2S与PLDα1响应干旱胁迫的作用研究

以野生型拟南芥WT、PLDα1合成缺陷突变体pldα1-1以及L-半胱氨酸脱巯基酶(L-cysteine desulfyrase,L-CDes)合成缺陷突变体lcd-4幼苗为材料,以0.3 mol·L~(-1)甘露醇模拟干旱胁迫,研究磷脂酶Dα1(phospholipase Dα1,PLDα1)与气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)响应干旱胁迫的作用及可能存在的信号关系。结果显示:干旱胁迫下,野生型拟南芥的H_2S含量、PLD与L/D-CDes活性及其基因相对表达量均发生显著的变化。萌发率实验中,与WT相比,pldα1-1和lcd-4对干旱胁迫更加敏感,外施NaHS可以促进干旱胁迫下WT、pldα1-1以及lcd-4种子萌发及內源H_2S产生,而外施PA能提高干旱胁迫下WT、pldα1-1种子萌发率及H_2S含量,但对lcd-4萌发率及H_2S含量没有显著影响。研究结果表明,信号分子H_2S和PLDα1在拟南芥的干旱胁迫响应中发挥一定的作用,且H_2S可能位于PLDα1的下游参与调控拟南芥种子萌发的信号过程。     

MODY3相关蛋白HNF1α第249位丝氨酸突变导致小鼠葡萄糖代谢异常

肝细胞核因子1α(HNF1α)不仅是调节葡萄糖代谢的重要转录因子,还参与肝、胰等多个器官中蛋白质合成、物质代谢、增殖分化相关基因的表达调控。HNF1α突变或表达异常引发包括青少年糖尿病3型(maturity onset diabetes of young 3,MODY3)在内的多种代谢疾病。Ser249是HNF1α重要的功能位点,该位点受ATM蛋白激酶直接磷酸化修饰,并可能是ATM蛋白激酶影响葡萄糖代谢的效应靶点,也可能是共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia,AT)患者糖代谢异常的致病靶点。为进一步研究Ser249磷酸化在体内的功能,本文构建人源野生型HNF1α转基因小鼠(WT小鼠)和HNF1αS249A转基因小鼠(S249A小鼠),对其基础代谢水平和葡萄糖代谢能力进行检测。相较于对照小鼠,S249A小鼠的多项基础代谢指标异常,WT小鼠未显示差异;但当小鼠接受刺激后,无论是注射葡萄糖,还是丙酮酸或胰岛素,相较于各自的对照小鼠,WT小鼠都表现出更强的反应性,而S249A小鼠的糖异生反应和胰岛素敏感性均未显示出差异。实时定量PCR结果表明,WT小鼠肝的多个糖代谢基因表达上调,但S249A小鼠肝中糖代谢基因上调幅度明显小于WT小鼠。本研究提示,HNF1αSer249突变导致小鼠糖代谢异常,可能与磷酸化修饰失调进而影响其转录活性有关。     

Studies on the effect of monoamine antagonists on the morphogenesis of the newt

The effects of three monoamine antagonists, p-chlorophenylalanine, diethyldithiocarbamate and propranolol on the morphogenesis of newt embryos were studied. Antagonists were administered during late blastula through neurula stages. In a concentration of 1 mM, all three arrested gastrulation and caused disintegration of the embryos. Lower concentrations (0.1-0.5 mM) retarded morphogenetic movements in the gastrulation and caused malformations especially in the anterior parts of the embryos; pigmentation was delayed by 1 or 2 days. In addition, p-CIPhe inhibited yolk granule degradation in the notochord and DEDTC caused notochordal hypertrophy. The results show that interference with synthesis or action of catecholamines and serotonin affects morphogenesis. With the methods used it is not possible to discover exactly how monoamines regulate the morphogenetic events because of the unspecific side effects of the antagonists and the feedback interactions between the monoamines.     

动态增强磁共振扫描与超声弹性成像对乳腺癌的诊断价值探讨

目的:探讨动态增强磁共振成像扫描与超声弹性成像对乳腺癌良恶性肿瘤的诊断价值,为临床诊断提供影像学依据。方法:回顾性分析2009年10月至2013年5月在我院经穿刺或手术病理证实为乳腺癌的59例患者的临床资料,患者术前均行超声与动态增强MR检查。依据病理组织活检和临床随访分别评价动态增强MR和UE对乳腺癌诊断的准确性。结果:DCE-MRI检测共发现病灶59个,55个初步诊断乳腺恶性肿瘤(BI-RADS 4-5),4个诊断为良性(BI-RADS 3),诊断准确率为93.22%(55/59)。UE对59个病灶进行评分,54个评分为乳腺恶性肿瘤,5个评分为良性,诊断率为91.53%(54/59)。UE检测乳腺癌的敏感性明显低于DCE-MRI及DCE-MRI+UE,DCE-MRI检测乳腺癌的特异性明显低于UE及DCE-MRI+UE,差异具有统计学意义(P0.05)。DCE-MRI+UE诊断乳腺癌的准确率为96.61%(57/59),明显高于DCE-MRI或UE单独检测的准确率(P0.05)。结论:动态增强MR诊断乳腺癌的敏感性较高,而超声弹性成像的特异性较好,两者联合可提高诊断准确率,对乳腺癌的早期诊断具有重要的临床应用价值。