猪生长激素基因在金鱼中的整合、表达与生物活性(英文)

自Ｐａｌｍｉｔｅｒ于１９８２年首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,培育出“超级鼠”以来,转基因动物技术获得迅速发展。本文以低等脊锥动物为实验动物,探讨猪生长激素基因导入金鱼受精卵后的整合与表达、生物学效应及后代遗传等问题,为进一步研究外源基因在高等脊椎动物（包括猪）内整合与表达的调控机理提供方法上的参考。实验结果表明：采用显微注射方法,将羊金属硫蛋白基因启动子与猪生长激素基因重组的线型ＤＮＡ（Ｆｉｇ．１）片段导入金鱼受精卵中,获得成活实验鱼,经斑点（Ｆｉｇ．２）,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．３）,筛选ＰＧＨ阳性的转基因鱼作为亲本交配,分别得到Ｆ１代和Ｆ２代。经斑点、ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｆｉｇｓ．４,５＆６）及放射免疫检测（Ｔａｂ．１）,表明外源基因在部分受体鱼中得到整合和表达,并能通过有性繁殖传递给后代,且仍具生长效应（Ｆｉｇ．７;Ｔａｂ．２）。本实验获得的转基因阳性金鱼数量有限,且只传了两代,似乎不足以说明转基因金鱼后代表观特征的遗传稳定,但转基因金鱼Ｆ１代中存在外源基因整合位点纯合的个体是可能的。这为建立转基因动物纯系奠定了基础。     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱。把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究。采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物。对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都     

利用杆状病毒表达系统表达金鱼生长激素I基因

以不含起始密码ATG的质粒Psxivvi⁺X3为转移载体,将编码金鱼生长激素I的Cdna插入粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)基因组中,构建了形成多角体的重组病毒株TnNPV—SX⁺gfGHl21a。该毒株能利用合成多角体XIV串联启动子,在重组病毒感染的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)昆虫细胞及银纹夜蛾幼虫中表达金鱼生长激素I基因。感染离体细胞及虫俸后的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳表明．所表达的蛋白分子量为22．5kDa,与理论计算值相符。Westem印迹证实。金鱼生长激素特异蛋白得到表达。     

猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究

将猪生长激素基因（ＰＧＨ）克隆到质粒ｐＵＣ１９上,经酶切分析,确定其酶切图谱．把ＰＧＨ转录起始位点以前的序列切掉,换上羊ＭＴ－１ａ基因的启动子,构建成可以调控的表达载体ｐＳＭＴＰＧＨ,用于转基因动物的研究．采用微注射法将线状ｐＳＭＴＰＧＨ导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物．对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这３种动物中的整合率均在９％以上,其生长速度都高于对照组．     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。     

带有猪生长激素基因的转基因鼠

为研究外源基因在转基因动物中的整合及表达调控的机制,我们首先进行了转基因鼠的研究。(a)外源基因片段的制备:把羊金属硫蛋白启动基因(SMT)和猪生长激素基因(PGH)与载体质粒pUC19相连接,构建成psMTPGH表达质粒。用BglI全酶切和     

人生长激素基因在转基因鲤鱼体内的遗传

通过有性繁殖转移入生长激素基因鲤鱼(P₁),获得了转基因鲤鱼的子一代(F₁)和子二代(F₂);外源基因在转基因P1与普通鲤鱼杂交产生的F₁代和转基因F1代自交产生的F₂代鱼中的存在率分别为45．4％和66．7％,外源基因拷贝数在子代个体之间存在很大差异,从每细胞2拷贝到每细胞200拷贝不等;外源基因在转基因鱼子代中仍可表达具有生物功能的产物．人生长激素(h1GH),并能促进鱼的生长。     

酶在有机相中催化酚类聚合的研究

酶曾-度被认为只能在水介质中起催化作用,而有机溶剂则会使其失活。由于大量化学反应都是在有机深剂中进行的,使得酶催化在有机合成中的应用受到极大限制。近年来少研究表明,只要条件合适,酶催化在有机介质中也可进行^[1.2],并已在实际应用中显示其优点,如肽的合成^[3,4]、旋光性物质的合成^[5,6]、不溶于水的化学物质的酶法分析^[7]、酯和酯交换反应^[8,9]、甾体氧化^[10]、脱氢的应^{[10]、酚类聚合反应[12].与一般化学催化相比,生物催化剂（酶）除了催化效率高,反应秉公执法曙和外,它具有亚格的选择性。例如对反应的专一性,化学基团的选择性,位置的选择性和对映选择性,因此,酶催化物别适合那些一般化学方法难以实现的手性化合物的选择性转化[13,14].}     

生物激素释放因子在动物骨骼肌的表达

生长激素释放因子是由动物和人的下丘脑合成并分泌的多肽,具有促进生长激素合成与分泌的作用,从而提高动物生长速度,向肌肉组织注射质粒DNA,外源基因可以较稳定表达一定的影响,将含生长激素释放因子基因的表达质粒注射动物肌肉组织,可能成为一种刺激动物生长的新方法。     

生长激素释放因子在动物骨骼肌的表达

生长激素释放因子是由动物和人的下丘脑合成并分泌的多肽,具有促进生长激素合成与分泌的作用,从而提高动物生长速度。向肌肉组织注射质粒DNA,外源基因可以较稳定表达一定的时间。将含生长激素释放因子基因的表达质粒注射动物肌肉组织,可能成为一种刺激动物生长的新方法。     

外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1, hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位,应用Southrn印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数.结果表明,外源基因是以单拷贝、单位点形式整合;应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合.结果证明,该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子,外源基因整合在17号染色体E区;反向PCR法（Inverse PCR, IPCR）克隆出约3.8 kb外源基因整合位点处的侧翼序列.分析表明,外源基因整合在17号染色体E1.3区,ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因第23个内含子区域.结果提示,获得的转基因小鼠为纯系,外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上,并能遗传给后代.     

人载脂蛋白A1基因转基因小鼠的建立

目的建立系统性表达人载脂蛋白A1(APOA1)基因的转基因小鼠。方法 将人APOA1基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOA1转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标。结果建立了2个不同表达水平的人APOA1基因的转基因小鼠品系;转入的人APOA1基因在血液、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、血管组织中均有明显表达;血生化分析结果显示不同月龄转基因小鼠的血浆高密度脂蛋白胆固醇水平高于同龄的野生型小鼠,甘油三酯水平低于同龄野生型小鼠。结论成功建立了系统性表达人APOA1基因的转基因小鼠,为研究高血脂以及高血脂相关的心血管病提供了工具。     

人生长激素基因导入金鱼受精卵内的整合、表达和促生长效应研究

通过显微注射法把小鼠ＭＴ启动子与人生长激素的融合基因（ＭＴ－ｈＧＨ）导入红龙睛金鱼受精卵内,共注射１５０６个卵子,获得８００多尾成鱼。经斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交表明,导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因与部分受体鱼的染色体ＤＮＡ发生了整合,整合率为２２％,转基因鱼血清中的生长激素含量平均高于对照组,平均生长速度高于对照组。导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因可以遗传给后代。     

Production of transgenic mice carrying the Thanatin gene by intratesticular injection

Transgenic animals have potential applications in medicine, life sciences, and biopharmacy. In this study, we developed a convenient, economic, and efficient method for gene transfer by transfection of male spermatogonial stem cells. Three fragments of the Thanatin gene, encoding an antibacterial peptide, were synthesized and amplified by overlap extension polymerase chain reaction (PCR). They were inserted into vector pIRES2-EGFP. The pIRES2-EGFP-Thanatin plasmid was mixed with liposomes and injected into the testes of male mice by a minimally invasive operation. Six weeks after injection, male mice were mated with normal female mice to produce an F1 generation. PCR and Southern blotting were performed to analyze F1 mice. Among those 52 F1 mice produced, 38.46% were found to be positive for the Thanatin gene by PCR and 30.77% by Southern blotting. Six positive mice were selected from the F1 generation and mated with normal females to an F2 generation, in which 36.36% were found to be positive for the Thanatin gene. Expression of the green fluorescence protein in the transgenic mice was confirmed by fluorescence imaging. These results showed that the Thanatin gene was integrated into the mouse genome. The study provides a useful method for the future development of disease-resistant animals and production of antibacterial peptides through transgenic animals.     

人β_2m转基因小鼠的制备及鉴定(英文)

 制备人 β2m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4基因的表达 .应用显微注射将人 β2m基因注入C5 7BL 6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 .出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本进行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2m转基因的表达 .6只原代仔鼠及 7只它们的下一代鼠 (F1)带有人 β2m基因 .由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL 6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11 4 % ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3 9% ) ,含有人 β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性 .整合的转基因均为单拷贝 .Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达 .在转基因动物制备中 ,C5 7BL 6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代 .与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低 .得到的人 β2m转基因小鼠能够将人 β2m基困传给下一代 ,并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配 ,研究它的致病性     

心脏特异性高表达hAPE1基因小鼠的构建与鉴定

本研究拟建立心脏特异性表达hAPE1转基因小鼠,为研究hAPE1基因功能及其突变与心脏发育和心血管疾病的关系提供工具动物。将人APE1(human APE1,hAPE1)基因插入到心脏特异性启动子α-肌球蛋白重链(α-MHC)下游,构建了心肌细胞特异性表达hAPE1的转基因表达载体,显微注射法导入C57BL/6J小鼠受精卵中,经胚胎移植获得转基因首建者小鼠,建立hAPE1转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,Western blotting鉴定h APE1蛋白在心脏中的表达并筛选高表达的转基因品系。研究表明,将含有心肌细胞特异性α-MHC启动子和hAPE1基因的转基因载体进行显微注射于小鼠胚胎中,接着将胚胎移植入假孕母鼠的输卵管中发育,建立了心脏组织特异性高表达hAPE1转基因小鼠品系,获得子代小鼠40只。PCR检测发现有15只小鼠在其基因组上整合有hAPE1基因,Western blotting检测hAPE1在这些小鼠心脏中高度特异性表达。本研究成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达hAPE1的转基因小鼠,为研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

肝组织特异表达人核受体nr5a2转基因小鼠的构建

人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子（hB1F）系Ftz—F1（NR5A）亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1 fcDNA置于小鼠白蛋白增慢子／启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卯回输至假孕母鼠输卯管。产下仔鼠经PCR和Southern blotting鉴定,同时RT—PCR和Western blotting分析转基因的表达。阳性Founder鼠与正常C57鼠交配以建立转基因纯系小鼠,F1代以PCR法鉴定。结果共获得4只PCR鉴定转基因阳性Founder鼠,其中一只同时经Southern blotting鉴定为阳性。RT—PCR和Western blotting结果显示,外源基因在转基因小鼠的肝组织成功表达。遗传学分析表明,转基因已整合入小鼠基因组并可稳定溃传。     

Production of transgenic fish: introduction and expression of chicken delta-crystallin gene in medaka embryos

To produce a model of transgenic fish, recombinant plasmids containing chicken delta-crystallin gene were microinjected into the oocyte nucleus of a small teleost, medaka (Oryzias latipes). About 50% of the microinjected oocytes developed to 7-day-old embryos. By Southern blotting delta-crystallin gene was detected in 4 of 8 embryos, and, by Western blotting, delta-crystallin polypeptides in 5 of 16. In 1 of 6 examined histologically, delta-crystallin DNA was detected in all the tissues, and delta-crystallin polypeptides, in many of the tissues including the lens. Thus, the exogenous gene and/or its products were detected in 10 of 30 embryos examined. This is the first report of successful production of transgenic fish.     

Construction of Plant Expression Vector with Double Resistance to Virus and Insect and Identification of Transformation in Tomato

By in situ hybridization of bacterium clone and analysis of restriction enzyme digestion, both CMV-cp gene and Bt-toxin gene were inserted one by one into T-DNA of binary plant expression vector pea. The reconstructed plasmid was named pE14. Then, tomato was transformed with pE14 mediated by Agrobacterium tumefaciens GV311-SE, four regenerated tomato plants were obtained on the MS medium containing 100 μg/mL kanamycin. Assay of nopaline, dot blotting of tomato genomic DNA and PCR amplication of CMV-cp gene and Bt-toxin gene from genomic DNA showed that CMV-cp gene and Bt-toxin gene were transferred into the four regenerated tomato plants simultaneously with T-DNA, and no recombination of genes occurred. RNA dot blotting showed that two of them could express simultaneously the CMV-cp gene and Bt-toxin gene proteins. The resistances to virus and insect of the transgenic tomato plants will be tested in their F1 and F2 regenerations.     

Novel gene transfer into the fertilized eggs of gold fish (Carassius auratus L. 1758)

Novel gene which was microinjected into fertilized eggs of the goldfish replicated during the embryogenesis. A proportion of the novel gene has been integrated into the host DNS of the 50-day-old transgenic goldfish.