斑马鱼过氧化物还原酶的生物信息学分析

[目的]利用生物信息学方法分析斑马鱼过氧化物还原酶Peroxiredoxin(Prx)家族的结构和功能。[方法]基于NCBI数据库中的BLAST程序,搜索斑马鱼Prx序列,从蛋白质氨基酸序列比对、系统发育、信号肽、跨膜区、二级结构、高级结构及蛋白质相互作用等方面进行解析。[结果]斑马鱼Prx家族有6个成员(Prx1-Prx6),均含有抗氧化活性半胱氨酸Cys,不含有跨膜结构域,仅Prx4含有信号肽。Prx1-Prx4序列同源性大于50%,有共同的祖先。Prx1-Prx5可与硫氧还蛋白相互作用,Prx6可与谷胱甘肽相互作用。脯氨酸、苏氨酸和精氨酸在空间结构上与斑马鱼Prx活性半胱氨酸接近,有利于Prx抗氧化活性发挥。[结论]斑马鱼Prx蛋白结构具有脊椎动物Prx特点,具有潜在的抗氧化生物学活性。     

中国明对虾过氧化物还原酶基因在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定

过氧化物还原酶（Prx）是生物体内广泛存在的一类酶,在消除过氧化氢和抗氧化胁迫中起着重要的作用。本研究采用PCR扩增编码中国明对虾Prx成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pCR®T7/NT TOPO® TA中进行体外重组表达。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS后,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行LC–ESI–MS分析,结果表明融合蛋白的四个肽段与中国明对虾Prx相应肽段完全一致。将重组蛋白通过金属螯合柱进行纯化,进而透析、复性,最后获得了具有较高过氧化物酶活性的重组Prx。中国明对虾Prx的成功表达,为深入研究其在中国明对虾免疫反应和抗氧化胁迫中的作用奠定了基础。     

苹果铁结合蛋白基因（＊＊Apf1）的克隆和序列分析

铁结合蛋白是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的铁储藏蛋白,是动、植物生长发育使用的储存铁的唯一共同来源.该蛋白在植物体中的主要功能是在种子形成、叶片衰老或环境中铁过量时积累,在种子萌发或质体绿化过程中释放铁,从而调节植物对铁的吸收和释放[1,2].同时,该蛋白也是解决全球动物和人类饮食缺铁有效的方法[3].转基因研究证明大豆铁结合蛋白基因能提高水稻种子中铁结合蛋白的的含量[4].同时在转基因烟草植株后代中由于叶片中积累了铁结合蛋白而对病毒引起的坏死和真菌的感染表现出耐性,对因各种环境胁迫而导致的细胞氧化性损伤有保护作用[5].铁结合蛋白基因是植物体内唯一依赖于铁而进行表达的基因[6].     

过氧化物酶V在顺铂诱导HepG2肝癌细胞凋亡过程中的调控作用

过氧化物酶V(peroxiredoxin V, Prx V)是过氧化物酶家族(peroxiredoxins, Prxs)中的一员,具有清除细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的功能。该文主要阐明了Prx V在顺铂(cisplatin, CDDP)诱导Hep G2人肝癌细胞凋亡过程中的调控作用。该研究利用顺铂处理Hep G2肝癌细胞,通过荧光显微照相、流式细胞术、蛋白质免疫印迹分析等方法检测细胞内活性氧(ROS)水平、细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白水平。研究结果表明,顺铂可引起细胞内的ROS水平升高导致细胞凋亡,同时造成细胞内Prx V蛋白质表达水平下降。利用慢病毒载体过量表达Prx V基因后,顺铂诱导的Prx V过量表达型HepG2细胞凋亡率明显低于Mock组,同时促凋亡蛋白cleavage-Caspase-3、Bad、cleavage-PARP表达水平也明显被下调,说明Prx V在顺铂诱导HepG2细胞凋亡过程中具有一定的抑制作用。该研究初步探究了Prx V在顺铂诱导的HepG2肝癌细胞凋亡过程中的调控作用,为肝癌的治疗研究提供了新的思路和治疗靶点。     

氧化应激时Peroxiredoxin Ⅱ膜质转移对红细胞渗透脆性的影响

为了探讨氧化应激时peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)膜质转移对红细胞渗透脆性的影响,检测了H_2O_2处理后红细胞渗透脆性的变化,并利用蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测了红细胞内PrxⅡ膜质转移情况,以及红细胞膜蛋白——带3蛋白(band 3)和血影蛋白(spectrin)的变化情况。研究结果显示,氧化应激时红细胞渗透脆性增加,红细胞内PrxⅡ从细胞膜转移至细胞质中,同时维持红细胞膜稳定、细胞骨架结构功能完整的相关蛋白质——band 3和spectrin在红细胞膜上表达量减少。实验结果证明氧化应激时红细胞内PrxⅡ发生膜质转移,引起维持红细胞膜稳定、细胞骨架结构功能完整的相关蛋白质band 3和spectrin表达量降低,导致红细胞渗透脆性增加。     

小鼠Prx2正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建小鼠Prx2正义及反义真核表达载体pEGFP-Nl-sPrx2、pEGFP-N1-aPrx2并在小鼠卵巢颗粒细胞中表达。方法:应用RT-PCR技术,从小鼠卵巢颗粒细胞提取的总RNA中,获得Prx2基因编码序列的正义及反义片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至体外培养的未成熟小鼠颗粒细胞,通过荧光显微镜观察和Westernblot检测其在颗粒细胞中的表达改变。结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-sPrx2、pEGFP-Nl-aPrx2构建成功,荧光显微镜观察及Western blot确认目标蛋白在颗粒细胞中表达增强或减弱。结论:成功构建小鼠Prx2基因正义及反义真核表达载体pEGFP-N1-sPrx2、pEGFP-N1-aPrx2并在小鼠卵巢颗粒细胞中表达。     

小鼠Prx2正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的：构建小鼠Prx2正义及反义真核表达载体pEGFP-N1-sPrx2、pEGFP-N1-aPrx2并在小鼠卵巢颗粒细胞中表达。方法：应用RT—PCR技术,从小鼠卵巢颗粒细胞提取的总RNA中,获得Prx2基因编码序列的正义及反义片段,克隆至真核表达载体pEGFP—N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至体外培养的未成熟小鼠颗粒细胞,通过荧光显微镜观察和Westernblot检测其在颗粒细胞中的表达改变。结果：酶切和测序证明重组真核衰达载体pEGFP—N1一sPrx2、pEGFP—N1-aPrx2构建成功,荧光显微镜观察及Westernblot确认目标蛋白在颗粒细胞中表达增强或减弱。结论：成功构建小鼠Prx2基因正义及反义真核表达载体pEGFP-N1-sPrx2、pEGFP-N1．aPrx2并在小鼠卵巢颗粒细胞中表达。     

Peroxiredoxin V保护HT22小鼠海马神经细胞抵抗NO诱导的细胞凋亡

Peroxiredoxin V(Prx V)是过氧化物酶peroxiredoxins家族中的一员,在神经细胞中含量丰富,具有通过清除细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和过氧亚硝酸盐抑制氧化应激诱导的细胞凋亡的作用。过量的一氧化氮(nitric oxide,NO)具有较强的神经毒性,可引起小胶质细胞炎性反应,诱导神经细胞凋亡从而引发神经退行性疾病,而且可诱导神经小胶质细胞Prx V的表达,参与小胶质细胞的活性调控过程。但是,NO诱导的海马神经细胞凋亡过程中Prx V的作用尚不清楚。该研究利用硝普化钠(sodium nitroprusside dihydrate,SNP)作为NO供体,检测了NO诱导的HT22小鼠海马神经细胞的凋亡及对Prx V蛋白表达的影响。结果显示,SNP诱导的HT22细胞凋亡呈现时间、浓度依赖性;并特异性地抑制了Prx V的表达,致使细胞内ROS水平升高,激活线粒体依赖的经典凋亡途径,导致HT22细胞的凋亡。该研究结果揭示,NO通过抑制细胞内Prx V的表达导致细胞内ROS水平升高,最终诱导HT22细胞发生凋亡的机制,为保护NO诱导的神经细胞凋亡提供了新的理论依据。     

福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达、纯化、活性检测及晶体生长的初步研究

Sf2523蛋白属于硫氧还蛋白过氧化物酶(Prx)家族,在有氧代谢过程中消除活性氧,起到保护生命大分子的重要作用.通过构建原核表达体系,可溶性表达并纯化了Sf2523酶蛋白,并对蛋白进行了过氧化物酶活性检测,证明其依然具有天然活性,酶的核心结构并未发生变化.由分子排阻色谱结果发现,酶蛋白体内和体外聚集状态不同,离体蛋白聚集状态不稳定,趋于二体化.将纯化的单体蛋白即时进行了结晶实验,初筛长出了针状晶体.通过进一步切除标签蛋白进行优化处理,最终得到了均匀的三维单晶.     

昆虫保幼激素促进家蚕杆状病毒系统的基因表达

杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression VecterSvstem,BEVS)的一个最大优点是外源基因的高效表达(Hy-perexpression).但是,不同的外源基因在BEVS系统中的表达水平相差很大,较低的如α-干扰素,表达量为1～5mg/L培养细胞;高的如β-半乳糖苷酶,表达量可达600mg/L培养细胞.外源基因在BEVS系统中表达量受到诸多因素的影响,如细胞的类型与质量,外源基因蛋白的性质,启动子序列的完整性,是否为融合蛋白等[1].如何使外源基因在BEVS系统中高效表达,是近年来该领域中研究最活跃的方向之一.已证实家蚕杆状病毒的表达量受宿主遗传型的影响,最低和最高的遗传型相差达7倍以上[2].林水中等发现家蚕饲料中添食适当浓度的硫酸铜可提高外源基因单位表达量10%左右[3].杆状病毒在复制循环中表现出两种类型:芽生病毒和包涵体病毒,其中芽生病毒引起宿主体内不同组织间的感染,包涵体病毒则引起宿主之间感染[1].杆状病毒基因组中蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(egt)基因影响激素在宿主体内的平衡[4],egt基因通过糖基化作用使蜕皮激素失活,打破宿主体内的激素平衡,延长幼虫期,以利于病毒的增殖[5].家蚕血淋巴中保幼激素(Juvenile hormone,JH)的滴度同样决定着幼虫发育的进程[6],本文通过体表使用保幼激素,以研究保幼激素对家蚕核型多角体病毒和宿主之间的相互关系及对外源基因表达量的影响.     

按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达

人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难.而尖锐湿疣与HPV6感染之间是单一的因果关系,这为用疫苗预防提供了可能.实际上HPV(如16、18、6、11等型别)L1的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗正在进行Ⅱ期临床试验,前景看好[1].但是现在普遍采用昆虫细胞培养系统,价格昂贵.为降低成本,同时尝试了真核表达系统甲醇营养型酵母(Pichiapastoris)和原核表达系统大肠杆菌(E.coli)两种表达系统.按照Pichia酵母的密码偏爱性重新合成HPV6-L1基因,结果在该系统仅有少量表达[2].但是发现该合成基因在E.coli中能够高效表达,而目前文献报道的HPV L1蛋白多以融合方式(与GST)在E.coli中少量表达[3].现将工作结果报道如下,并对影响蛋白表达的可能因素作简要探讨.     

T4噬菌体表面展示技术的研究进展

噬菌体表面展示技术(phage display)是由Smith于1985年首先建立起来的一种新的生物技术[1],它能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,保持相对独立的空间构象和原有的生物活性[2].常用的噬菌体表面展示系统主要有丝状噬菌体、λ噬菌体及T4噬菌体展示系统等.虽然它们都具有噬菌体展示系统的优点,但对于丝状噬菌体来说,它不能展示那些难以分泌的肽和蛋白质,而且它的N端可融合外源多肽的容量有限,较大蛋白的融合会造成空间障碍,影响噬菌体的装配,使其失去感染力.而对于λ噬菌体,大分子蛋白的融合会抑制噬菌体的组装,使其生长受到影响,因此这两种噬菌体更适用于构建短肽库和cDNA表达文库[3],而不适于构建重组疫苗和表达分子量大具有完整结构域的蛋白质[4,5].     

水稻草矮病毒核衣壳蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国也有分布[1].其病原是水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV),为纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组RNA组成[2].基因组含六个ssRNA片段,均为双义编码[3,4],其中RNA5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NCP)[3].本文报道应用RT-PCR技术获得RGSV沙县分离株(RGSV-SX)NCP基因的cDNA克隆,并得到其在大肠杆菌中的表达产物.     

转录因子LRF蛋白POZ结构域的表达与纯化

[目的]旨在原核表达转录因子LRF的POZ结构域,纯化获得GST-POZ融合蛋白。[方法]以SD大鼠海马组织c DNA为模板,利用PCR扩增带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的LRF基因的POZ结构域,并将其插入到原核表达载体p GEX-4T-1中,将构建成功的p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,再利用MagneGST particles亲和纯化GST-POZ融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定融合蛋白。[结果]p GEX-4T-1-POZ原核表达质粒构建成功;在37℃条件下,浓度为0. 2 mmol/L的IPTG诱导7 h能够使重组蛋白大量表达,经MagneGST particles纯化后的GST-POZ重组蛋白能够被识别LRF的抗体特异性识别。[结论]纯化后的GST–POZ重组蛋白能够用于后续的生物学研究。     

噬菌体表面表达抗汉坦病毒衣壳蛋白单链抗体的研究

噬菌体展示表达(Phage display expression)的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一 在同一噬菌体颗粒内,其基因组中含有表达蛋白基因,在噬菌体表面进行特定的表达.该技 术为研制工程抗体提供一新的途径,在九十年代逐渐被人们认识并得到极其广泛的应用 [1,2].噬菌体表面表达技术适于表达Fv和Fab分子片段,当表达的抗体基因与噬菌 体外壳蛋白基因Ⅲ融合时,在噬菌体颗粒表面呈现单价表达,与噬菌体外壳蛋白基因Ⅷ融合时,呈现多价表达.     

P53基因及其相关抗体在原发性肝癌中的研究进展

肝癌是我国乃至全世界最常见的消化道肿瘤之一.我国的肝癌发病率和死亡率占全球每年新发病率和病死率的55%[1].越来越多的证据表明,P53基因的突变与失活和肝癌的发生发展有着密切联系[2].由于血清P53抗体表达水平与肿瘤组织P53基因突变及P53蛋白积累程度相一致,而使P53蛋白及其抗体成为研究热点[3].现对P53基因及其抗体在原发性肝癌临床应用中的研究进展综述如下.     

转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究

利用转基因动物乳腺生产药用蛋白质是近年来研究的热点,在这方面已有不少成功的例子,展现出良好的应用前景[1,2].本研究选择人瘦蛋白基因作为目标基因是因为其表达产物瘦蛋白能对人体内脂肪的蓄积和能量消耗进行有效的反馈调控,美国科学家已将用E.coli表达的人瘦蛋白用于人肥胖症的治疗并取得了良好的治疗效果[3],但尚未见到利用转基因动物乳腺表达这种蛋白质的研究报道.     

ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

[目的]使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP) ELP[Ⅰ]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[Ⅰ]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响.[方法]人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[Ⅰ]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达.融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值.[结果]成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[Ⅰ]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时,Tt为28.6℃;而当PEG的浓度为5％、10％、15％、20％时,Tt分别降至22.3℃、15.9℃、6℃、0℃.[结论]ELP[Ⅰ]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白.     

乳酸克鲁维酵母表达型T载体的研发及应用

[目的]构建以乳酸克鲁维酵母表达载体p KLAC2为基础的表达型T载体。[方法]利用定点突变技术突变载体p KLAC2上的XcmⅠ位点,获得表达载体p KL-MUT;PCR扩增含黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过EcoRⅠ和XhoⅠ位点连接至表达载体p KL-MUT,构建成重组载体p KL-YFP,限制性内切酶XcmⅠ酶切后即产生T载体p KL-T。连接融合基因14-3-3-Zs G转化至乳酸克鲁维酵母GG799。[结果]利用该T载体可成功克隆外源基因14-3-3-Zs G并在乳酸克鲁维酵母中表达14-3-3-Zs G蛋白,荧光和Western blotting验证正确。[结论]乳酸克鲁维酵母表达型T载体已成功构建,具有快速克隆高效分泌表达外源基因的特点,对于促进乳酸克鲁维酵母表达系统表达相关蛋白的产业化具有实际意义。     

Annexin Ⅰ蛋白在人前列腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨Annexin Ⅰ蛋白在前列腺癌组织中的表达及其与前列腺癌发生、发展、转移及预后的关系.方法:回顾性分析110例前列腺癌及40例前列腺增生组织中Annexin Ⅰ蛋白的表达与前列腺癌Gleason分级、年龄、临床分期、转移及预后的相关性.结果:前列腺癌患者的Armexin Ⅰ表达水平显著地低于良性前列腺增生症患者(P＜0.05);Annexin Ⅰ在低分化癌中表达较高,与高、中分化癌相比有显著性差异(P＜0.05);而高、中分化癌之间Annexin Ⅰ表达均较低,两者之间无显著性差异(P＞0.05).前列腺癌Annexin Ⅰ蛋白表达与年龄无关,而与临床分期、淋巴结转移及预后有关(P＜0.05).结论:Annexin Ⅰ蛋白表达下调与前列腺癌发生发展和预后密切相关,可作为反映前列腺癌生物学行为和判断预后的生物标记物.