多重耐药铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及 对多粘菌素B耐药机制探讨

摘要：目的 探讨多重耐药铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及对多粘菌素B耐药机制情况。方法 分析2008年2月至2014年2月收集分离的菌株收集200株铜绿假单胞菌,通过琼脂稀释法和E-test法对8种抗生素进行药敏试验,通过PCR对金属β-内酰胺酶基因进行扩增,在对多重耐药铜绿假单胞菌进行体外诱导,获得多粘菌素B的耐药菌株,观察临床分离株和诱导株pmrAB和phoPQ基因扩增和测序情况。结果 200株铜绿假单胞菌对于亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦耐药率均高于30%,200株铜绿假单胞菌对于阿米卡星耐药率最低仅为10%,敏感率最高达到90%。200株铜绿假单胞菌对于多粘菌素B药敏试验中197株敏感,3株中介,无耐药发生。通过B100、B108、B925三株临床分离株和多粘菌素B诱导耐药株B100d、B108d、B925d的phoP、phoQ和pmrB基因进行扩增。其中B108d号菌株的pmrB基因有两个点突变,在第5365842位的碱基发生了从GGC到AGC的突变,即361个G氨酸变成了S氨酸;第5365864位的碱基发生率从TCG到CCG突变,第368个S氨酸转变为P氨酸。B108d号菌株的1278614位点的碱基从TAC到TTC的突变,第84个Y氨酸变为F氨酸。另外B108d号菌株的phoQ基因中1278416-1278527位的基因发生缺失,进而缺失了152个氨基酸。结论 铜绿假单胞菌耐药率较高,但是没有出现多粘菌素B耐药菌株,诱导出的多粘菌素B耐药的多重铜绿假单胞菌PCR扩增后,出现了pmrB和phoQ基因的碱基突变,同时还有部分DNA片段缺失。     

RG108对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及RASSF1A基因表达的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂RG108对人肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡以及对RASSF1A（Ras as-sociation domain proteinfamily1）基因启动子区域甲基化状态、表达的影响。方法用20μmol/L的RG108对A549细胞进行化学干预72h,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术检测细胞周期以及凋亡情况;RT-PCR观察RASSF1A基因mRNA水平变化;Western blot检测RASSF1A蛋白的表达;甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测RASSF1A基因启动子区域甲基化状态的改变。结果经RG108干预72h后,A549细胞的抑制率为17.2±0.43%,细胞周期阻滞于G0/G1期,并引起细胞凋亡。RT-PCR和Western blot结果显示在干预组细胞中分别出现RASSF1A基因的DNA条带（329bp）和蛋白质条带（39kD）,而对照组中无相应条带出现。RASSF1A基因启动子区域由甲基化状态转变为非甲基化状态。结论RG108可使RASSF1A基因启动子区域去甲基化,并通过该机制诱导RASSF1A基因在人肺腺癌细胞株A549中表达。     

结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)合成酶Rv3586结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法:以Mtb基因组为模板PCR扩增Rv3586三个结构域基因,分别克隆入pEGFP-N3真核表达质粒,用菌落PCR、质粒酶切和测序方法对插入序列进行鉴定。通过脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因在COS-7细胞内的表达。结果:PCR成功扩增出Rv3586三个结构域基因,菌落PCR、质粒酶切和质粒测序鉴定结果表明成功插入目的片段,包含Rv3586的三个结构域基因的真核表达载体构建成功。间接免疫荧光法结果显示,Rv3586三个结构域蛋白在COS-7细胞中表达成功。结论:成功构建Rv3586三个结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达成功,为后续Mtb Rv3586结构域的功能和应用研究奠定了基础。     

水稻高代回交置换系穗颈长度的遗传分析

对以籼稻品种9311为受体、粳稻品种日本晴为供体的3个控制穗颈长度性状的高代回交置换系(C031、C108和C115)进行了农艺性状测定和遗传基础分析。结果表明, 除穗颈长度外, 3个置换系的株高与9311之间也存在显著或极显著差异, 置换系C031的每穗总粒数和千粒重与9311差异显著。通过遗传背景检测, 发现置换系C031和C115均含有2个日本晴置换片段, 置换系C108含有3个日本晴置换片段。遗传分析表明, 3个F₂分离群体中穗颈长度的分离均由单个孟德尔因子控制, 其加性效应分别为3.09、3.05和-2.04。连锁分析表明, C031和C108与携带置换片段上的分子标记均不连锁, C115与第12号染色体的分子标记存在不同程度的连锁, 表明控制C115穗颈长度表型的基因位于第12号染色体上, 将其命名为qPNL- 12。研究结果为精细定位和克隆该基因奠定了基础。     

应用基因芯片筛选鼻咽癌信号转导相关基因

目的：建立具有组织特异性的鼻咽癌基因表达谱,筛选鼻咽癌中信号转导相关基因。方法：采用深圳微芯公司基于玻片的包含8046个人类基因的基因芯片,检测7例鼻咽癌组织及1例鼻咽炎组织,初步获得鼻咽癌异常表达基因;结合GO分类从异常表达的基因中筛选信号转导相关基因,以Biocarta信号通路数据库查询筛选基因相关转导信号通路信息。结果：在鼻咽癌组织独得1241个异常用表达基因,其中高表达基因871个,低表达基因343个。发现28个差异表达基因与细胞的信号转导相关,其中表达上调的21个,表达下调的7个。结论：成功建立了具有组织特异性的鼻咽癌基因表达谱,初步获得了鼻咽癌信号转导相关基因。     

EGFL7 基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）重组慢病毒表达载体。方法：参照小分子干扰RNA 的设 计原则,应用OligoDesigner 3.0 软件设计三条靶向人EGFL7 基因的RNA干扰序列（hEGFL7-RNAi）,并将其分别插入含有绿色 荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pLV3 中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE 和pMD2G共同转染293T细胞,包 装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR 检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后靶基因mRNA 的水平,以评价 其基因沉默效果。结果：筛选出3 条人EGFL7 基因的RNAi 序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1× 108、2× 108和5× 108TU/mL,将其转染入HUVEC 后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论：成功筛选出三条针对人EGFL7基因的 RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs 中EGFL7 基因的表达。     

杆状病毒基因Ac108的克隆和原核表达

目的:克隆和表达苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa califorica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)开放阅读框108(open reading frame,ORF108,Ac108)基因,为进一步研究其功能打下基础.方法:将Ac108基因克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中表达AC108蛋白.以纯化的AC108蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔制备蛋白的多克隆抗体.用该抗体检测了该蛋白在病毒感染细胞中的表达.结果:实现了AC108蛋白的表达,获得了AC108蛋白的多克隆抗体,Western blot检测发现在AcMNPV感染的Sf-9细胞中有一条大小约为27kDa的杂交带,远大于预期的11kDa.结论:AC108蛋白可能以同源或异源聚合物形式在电场中迁移.     

人claudin-10基因启动子转录调控的初步分析

[目的]构建不同长度的人claudin-10基因上游启动子荧光素酶报告基因载体,并在LO2细胞中比较其活性。[方法]以人LO2肝细胞基因组DNA为模板,PCR扩增获得claudin-10基因5'侧翼序列,并将其插入p MD18-T载体;PCR扩增获得不同长度的claudin-10基因上游启动子区序列,构建p GL3-Basic系列荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,双荧光素酶报告基因分析系统检测转录活性。[结果]成功构建6个不同长度的人claudin-10基因上游启动子区(-1 451/+100bp、-1 022/+100bp、-1 005/+100bp、-677/+100bp、-377/+100bp和-108/+100bp)的报告载体;启动子活性实验结果表明:当claudin-10启动子片段从-1 005 bp截短至-677 bp,从-108 bp截短至+100 bp时活性显著下降(P0.05);其余截短时活性无改变(P0.05)。[结论]claudin-10启动子-1 005bp~-677bp和-108bp~+100bp区是claudin-10基因的主要转录调控区。     

农杆菌介导番茄铁载体蛋白基因(LeIRT2)转化烟草的研究

构建了含有目的基因(LeIRT2)的双元载体pYF840,并成功地将植物性内含子构建到筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)和gus报告基因中。利用农杆菌介导法,将铁载体蛋白(LeIRT2)基因导入革新一号烟草,PCR、PCR-Southern blotting及Southern blottlng检测结果显示,有3个烟草株系的基因组中整合了完整的铁载体基因(LeIRT2)。水培试验结果显示转基因株系1、3不但提高了植株的铁吸收能力,而且还促进了植株的生长,但转基因株系2却与对照无明显区别。     

胸腺肽基因对樱桃番茄的遗传转化

胸腺肽基因是一343bp的小肽基因,是从动物中克隆得到的。本文以“美味樱桃”番茄为植物材料,用农杆菌侵染法进行了胸腺肽基因的遗传转化。对所得再生植株进行了PCR和Southern blot检测及RT-PCR检测,34棵Kam抗性株通过目的基因PCR检测,4棵为阳性株,阳性株率为11．8%。实验中还对目的基因之后的Nos终止序列区进行了扩增,通过Nos Ter．引物对4株目的基因PCR阳性株作PCR检测．只有1株为阳性株,该植株经Southern blot检测和RT-PCR检测,均为阳性。这些检测结果说明胸腺肽基因成功地整合到番茄基因组中,并在转录水平上得以表达。     

弥漫大B细胞淋巴瘤1号染色体的基因表达分析

目的:探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-Cell Lymphoma,DLBCL)中1号染色体基因表达情况。方法:采用激光显微切割技术分离临床DLBCL病人淋巴结标本中的淋巴细胞,提取淋巴细胞的mRNA并与表达谱芯片杂交,通过信号扫描、处理后获得表达基因杂交信号强度。每基因设11-20对探针。杂交信号与错配探针对比,扣除背景值后,使用Wilcoxon符号秩和检验选取与错配杂交信号有显著差异的基因作为分析结果(P=0.05)。然后随机选取四个检测到的基因,使用PCR方法检验基因芯片结果的可靠性。结果:成功地从快速冷冻保存的DLBCL标本中提取RNA。使用表达谱芯片进行研究,发现了共316条1号染色体编码的基因在DLBCL细胞中表达。根据胞内定位,基因功能和基因所属的代谢通路三种分类方法对所得基因进行分类分析。基因表达密度分析显示DLBCL中1号染色体上的基因表达情况与编码基因分布情况存在统计学差异。结论:使用表达谱芯片研究了DLBCL中1号染色体上的基因表达情况。     

肉桂酸衍生物对铜绿假单胞菌PAO1 III型分泌系统的影响

【目的】铜绿假单胞菌是引起医院获得性感染最常见的条件致病菌,而III型分泌系统(Type III secretion system,TTSS)是其致病的主要因子之一。本文从合成的21个肉桂酸衍生物中筛选影响TTSS效应子(Effector)产生的化合物,并初步研究其作用机制。【方法】将TTSS效应子合成基因exoS的转录报告质粒pAT-exoS转入菌株PAO1中,获得PAO1(pAT-exoS)。待筛选的化合物与PAO1(pAT-exoS)菌株共培养6 h后,检测exoS基因的表达,从中筛选影响exoS基因表达的化合物。【结果】筛选结果表明：21个化合物中,3个化合物抑制exoS基因表达,2个化合物则促进exoS基因表达。此外,化合物TS128、TS143和TS160对菌株生长有明显的抑制作用。Western blot实验进一步证实筛选得到的化合物TS108、TS128和TS165可抑制ExoS的产生;化合物TS139和TS143则促进ExoS的产生。为进一步研究抑制剂的作用机理,过量表达TTSS主要的调控因子exsA基因可部分消除抑制剂TS108和TS165的抑制效果;而rsmZ rsmY双基因突变体PAO6421中添加抑制剂TS108和TS165并不能显著抑制exoS基因的表达,同样,抑制剂TS108和TS165也不影响受Gac/Rsm信号传导系统调控的群体感应信号分子的产生。【结论】抑制剂TS108和TS165的作用机制可能主要是影响esxA基因,从而影响exoS基因表达及蛋白产量。     

转抗虫基因三倍体毛白杨植株体内农杆菌残存与逃逸

用部分改造的BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂（APLA）基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法对三倍体毛白杨进行了转化,对转化后植株体内残存农杆菌在继代培养和移栽过程中进行了跟踪检测。结果表明：通过对转化再生植株的分子生物学检测,42个株系中,33个株系为阳性,阳性率达到80％;用Bt毒蛋白抗血清进行ELSA检测结果表明,7个转基因株系都有Bt杀虫蛋白表达;基因转化后,可采用附加50mg／L卡那霉素,300mg／L羧苄青霉素的筛选培养基消除细菌并进行抗性芽筛选。对28个转基因株系叶片、茎段和根段在含有卡那霉素50mg／LYEB培养基上进行细菌培养,通过在T-DNA区、质粒Vir区和农杆菌基因组设计引物,进行PCR检测,证明有3个株系（33、37、5号）检测到残存工程农杆菌,并在组培瓶中存活24个月。将带菌的3个株系组培苗移栽到花盆中,室内培养1个月后,在33号株系根际土壤中检测到了目的农杆菌。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

弥漫大B 淋巴瘤12 号染色体基因表达的研究

目的:研究弥漫大B淋巴瘤(Diffuse Large B-Cell Lymphoma,DLBCL)12号染色体基因表达情况。方法:收取临床DLBCL病人淋巴结标本液氮速冻,快速冷冻切片,采用激光显微切割技术分离单纯淋巴瘤细胞,提取淋巴瘤细胞中的mRNA与表达谱芯片杂交,通过信号扫描、处理后获得表达基因杂交信号强度。每基因设11-20对探针。杂交信号与错配探针对比,扣除背景值后,使用Wilcoxon符号秩和检验选取与错配杂交信号有显著差异的基因作为分析结果(P=0.05)。随机选取两个检测到的基因,使用PCR方法检验基因芯片结果的可靠性。结果:成功地从快速冷冻保存的DLBCL标本中提取了RNA。使用表达谱芯片进行研究,发现了共164条12号染色体编码的基因在淋巴瘤细胞中表达。并根据胞内定位,基因功能和基因所属的代谢通路三种分类方法对所得基因进行分类分析。基因表达密度分析显示12号染色体上的基因表达情况与编码基因分布情况比较一致。结论:使用表达谱芯片研究了12号染色体上的基因表达情况,为研究DLBCL提供了依据。     

肉桂酸衍生物对铜绿假单胞菌PAO1 Ⅲ型分泌系统的影响

【目的】铜绿假单胞菌是引起医院获得性感染最常见的条件致病菌,而Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,TTSS)是其致病的主要因子之一。本文从合成的21个肉桂酸衍生物中筛选影响TTSS效应子(Effector)产生的化合物,并初步研究其作用机制。【方法】将TTSS效应子合成基因exoS的转录报告质粒pAT-exoS转入菌株PAO1中,获得PAO1(pAT-exoS)。待筛选的化合物与PAO1(pAT-exoS)菌株共培养6 h后,检测exoS基因的表达,从中筛选影响exoS基因表达的化合物。【结果】筛选结果表明:21个化合物中,3个化合物抑制exoS基因表达,2个化合物则促进exoS基因表达。此外,化合物TS128、TS143和TS160对菌株生长有明显的抑制作用。Western blot实验进一步证实筛选得到的化合物TS108、TS128和TS165可抑制ExoS的产生;化合物TS139和TS143则促进ExoS的产生。为进一步研究抑制剂的作用机理,过量表达TTSS主要的调控因子exsA基因可部分消除抑制剂TS108和TS165的抑制效果;而rsmZ rsmY双基因突变体PAO6421中添加抑制剂TS108和TS165并不能显著抑制exoS基因的表达,同样,抑制剂TS108和TS165也不影响受Gac/Rsm信号传导系统调控的群体感应信号分子的产生。【结论】抑制剂TS108和TS165的作用机制可能主要是影响esxA基因,从而影响exoS基因表达及蛋白产量。     

禽蛋表面肠杆菌的分布及其喹诺酮耐药基因的检测

调查北京市禽类市场禽蛋表面肠杆菌的分布,及其喹诺酮耐药基因携带状况。共采集禽类市场禽蛋表面涂抹物标本65份,经肠杆菌SS培养基上培养,根据形态和颜色不同,获得108个单菌落,鉴定为11个种或属,构成比最多的前3个种属分别是埃希氏菌属(42.6%),克雷伯菌(17.6%)和假单胞菌(12.0%)。在所有108株菌中,共30株菌(27.8%)检测到喹诺酮(qnr)耐药基因,其中qnrBm阳性率为23.2%,qnrAm阳性率为6.5%,但未检测到qnr Sm基因;qnrAm与qnrBm同时呈阳性的有2株菌。按种属不同,除泛菌属外,其他10个种属的细菌均检测到喹诺酮耐药基因,最多的为埃希氏菌属(8株),其次为柠檬酸菌属(6株),以及普罗威登斯菌(3株)和克雷伯菌(3株)。得出结论 :北京市禽类市场禽蛋表面携带的肠杆菌种类较多,喹诺酮耐药基因分布较广,相关部门应加强对禽蛋中肠杆菌的监测和用药管理。     

棉铃虫(Helicoverpa armigera)FK506结合蛋白基因的克隆、表达与纯化

为了深入了解FK506结合蛋白基因的作用和探索调控棉铃虫CYP6B6的表达机制,基于单酵母杂杂交结果采用RT-PCR的方法从棉铃虫的中肠cDNA中扩增得到了FK506结合蛋白基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21中用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,通过镍柱离子亲和层析纯化目的蛋白。用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和纯化结果,并用Western blotting进行验证。结果表明,克隆得到的目的基因大小为327 bp,编码108个氨基酸残基,预测蛋白质分子量和等电点分别是11.78 kD和7.87。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。重组质粒pET32a-FKBP在大肠杆菌BL21中获得表达,主要以可溶性形式存在,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blotting检测发现纯化的目的蛋白大小正确且纯度高。     

Alzheimer氏病的遗传学研究进展

概述了目前已经确认的Alzheimer’sDisease（AD）的四个致病基因或相关基因,其中与早老性AD相关的有三个,分别是位于第21号染色体的app基因、第14号染色体的prisenilinⅠ基因和第1号染色体的prisenilinⅡ基因;与迟老性AD病相关的是位于第19号染色体的apoe基因。在早老性AD家族中发现了：（1）app基因的五个突变体;（2）编码跨膜蛋白的presenilinⅠ基因与线虫编码相同蛋白的sel-12基因有高度的同源性。apoe基因与AD发病有“剂量效应”。早老性AD中一种高效转基因鼠模型已被成功地建立。     

构建基于荧光多重cPCR的小鼠基因拷贝数检测方法

目的建立基于竞争性聚合酶链式反应(competitive polymerase chain reaction,cPCR)小鼠基因拷贝数变异(copy number variations,CNVs)的检测方法,用于检测野生小家鼠来源一号染色体替换系群体(population of specific chromosome 1 substitution strains,PCSSs)的CNVs。方法选取小鼠一号染色体上11个CNVs位点,及7、9和X染色体上各1个内对照位点,分别构建克隆质粒为竞争性粒模板,应用cPCR技术,建立荧光通用引物多重cPCR检测方法。结果多重cPCR方案适用于小鼠一号染色体上11个CNV位点的拷贝数检测,且能准确检测X染色体的拷贝数。结论实现小鼠快速、高通量的CNVs检测,可准确检测小鼠1号染色体中11个CNV位点的拷贝数变异。