EGFL7基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定（英文）

目的:构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒表达载体。方法:参照小分子干扰RNA的设计原则,应用Oligo Designer 3.0软件设计三条靶向人EGFL7基因的RNA干扰序列(h EGFL7-RNAi),并将其分别插入含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pLV3中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G共同转染293T细胞,包装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后靶基因mRNA的水平,以评价其基因沉默效果。结果:筛选出3条人EGFL7基因的RNAi序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1×10~8、2×10~8和5×10~8TU/mL,将其转染入HUVEC后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:成功筛选出三条针对人EGFL7基因的RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs中EGFL7基因的表达。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

靶向ADAM17基因RNA干扰慢病毒载体的构建及慢病毒包装

目的构建靶向ADAM17基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体及包装慢病毒。方法根据人ADAM17mRNA序列设计4个靶序列,合成4对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上5对寡核苷酸序列退火后连入pLVTHM质粒,经酶切和测序鉴定。将重组慢病毒质粒转染至A549细胞,以Real-time PCR检测A549细胞中ADAM17 mRNA表达。将干扰效果最佳的质粒载体和包装质粒共转染至293T细胞,包装产生病毒颗粒。以流式细胞术检测重组慢病毒的滴度。结果酶切和测序证实干扰靶序列已被准确克隆到pLVTHM质粒载体。pLVTHM-ADAM17-siRNA1-4均可显著抑制A549细胞ADAM17 mRNA的表达,其中pLVTHM-ADAM17-siRNA4的抑制效果最佳。LV-ADAM17-siRNA4重组慢病毒的滴度为2.16×108TU/ml。结论成功构建了靶向人ADAM17基因RNAi慢病毒载体及包装了重组慢病毒。     

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

Noggin基因沉默表达载体的构建及效果评价

目的构建慢病毒介导的Noggin RNAi干扰序列,并分析这些干扰序列对Noggin基因的沉默效果。方法针对目的基因Noggin的m RNA设计四条干扰序列,并将这些序列连接到Lenti-KD慢病毒载体,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染MC3T3-E1细胞,利用puromycin进行筛选,获得稳定表达细胞系。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分析不同干扰序列的干扰效果。结果实时荧光定量PCR结果显示,四种干扰序列对Noggin基因的表达都有一定的沉默效果,但只有sh Noggin-1(P0.01)对其表达影响显著。Western blot结果显示,四种干扰序列中只有sh Noggin-1(P0.01)对Noggin的表达蛋白具有显著的降低作用。结论获得了一种Noggin基因的干扰序列,该序列能够干扰Noggin基因m RNA的稳定性,从而影响蛋白的表达。该干扰序列可以用于部分敲除Noggin基因,从而用于研究Noggin基因的功能。     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经293T细胞包装,病毒滴度为(3-8)×108 TU/m L;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用, 构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs (rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列, 设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面, 产生pRiCXCR4, 将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP, 产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞, 包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后, 用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示, 酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确, 产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP, 未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后, 与空载体组和空白组相比, 3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达, CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%, 抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功, 为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。     

High FFA-induced proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial cell partly through Wnt/β-catenin signal pathway

Free fatty acids (FFA)-induced proliferation and apoptosis was studied in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A recombinant adenovirus containing a RNAi cassette targeting the GSK-3β gene was produced and its silencing effect on GSK-3β gene was detected by Western blot analysis and immunohistochemistry assay in HUVECs. The effect of the RNAi on the protein level of β-catenin was explored by transfecting the RNAi adenovirus to inhibit the expression of GSK-3β protein. The subsequent effect on the Wnt/GSK-3β/β-catenin signal pathway and on proliferation and apoptosis of HUVECs cultured with FFAs, was analyzed by BrdU assay, Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit, and 4′,6-diamidino-2- phenylindole(DAPI) to explore the possible connection between the signaling pathway and FFA-induced proliferation and apoptosis. The Western blot results showed that the expression of GSK-3β protein in HUVECs could be inhibited efficiently by the RNAi adenovirus, and that the protein level of β-catenin was increased by RNAi adenovirus transfection. The results of the BrdU assay suggested that knockdown of GSK-3β with the RNAi adenovirus may stimulate the proliferation of HUVECs. Apoptosis was observed in HUVECs exposed to FFAs (0.75 mmol/L) for 72 h, and this effect could be partly reversed when interfering with the RNAi adenovirus. It may be concluded that the RNAi adenovirus specific to GSK-3β may partly protect HUVECs from apoptosis induced by FFAs, probably through the up-regulation of the Wnt/β-catenin signal pathway.     

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A 细胞Tmub1 基因沉默及稳定感染细胞 系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。     

慢病毒介导RNA干扰SOCS3基因在猪前体脂肪细胞和成肌细胞中的表达

构建细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)慢病毒干扰载体,获得有感染性的病毒颗粒,感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞,并检测其对前体脂肪细胞的干扰效率.首先设计并合成3对针对目的基因SOCS3的siRNA序列,退火后连接于LentiH1上,测序验证后,与包装质粒△8.9和vsv-g共转染到293T细胞中进行包装和浓缩,纯化后测定病毒滴度,然后感染猪前体脂肪细胞和成肌细胞.重组慢病毒载体LentiH1-siRNA经酶切和测序鉴定正确,病毒滴度为3×107tu/mL,感染猪成肌细胞和前体脂肪细胞后,可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western印迹分析表明,前体脂肪细胞中SOCS3的表达被显著下调,其中LentiH1-siRNA3介导对SOCS3基因mRNA和蛋白的干扰效率分别达53%和71%.本研究成功构建了猪SOCS3慢病毒干扰载体,感染猪前体脂肪细胞能稳定沉默SOCS3基因的表达,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础.     

人工锌指核酸酶的设计与表达纯化

设计表达了四个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9 bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计两个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。