棉花原生质体再生小植株

80年代植物原生质体培养取得突破性进展,水稻、小麦、玉米和大豆等重要农作物先后获得再生植株。但棉花原生质体培养至今仍停留在细胞分裂和形成细胞团阶段,原生质体培养得到愈伤组织仅有一例。本文首次报道从陆地棉柯字棉312品种的细胞悬浮培养系原生质体培养获得再生小植株的试验结果。     

由小-簇麦杂种悬浮细胞和原生质体再生植株

１９８８年以来,小麦原生质体培养取得了重要进展［１—７］,但成功还仅限于少数基因型,因此,为了建立和不断完善小麦及其他禾谷类植物原生质体培养的技术体系,还有待在更多的基因型中进行探索。在小麦远缘杂种系统中,１９９０年王铁邦等［８］培养小－偃麦原生质体获得成功。本文报道由普通小麦－簇毛麦杂种悬浮细胞和原生质体再生植株的结果。材料和方法起始材料取自本实验室继代保存近２年的小－簇麦杂种（２ｎ＝４ｘ＝２８）愈伤组织。该愈伤组织是由小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．,品种：“农大１４６”）×簇毛麦…     

激发子诱发的小麦叶肉细胞原生质体[Ca2+]cyt升高主要源于胞外钙离子内流

以小麦叶肉细胞原生质体-激发子互作为研究体系,借助共聚焦激光扫描显微镜观察结合药物学试验,对激发子刺激后不同抗叶锈性小麦品种原生质体[Ca2+]cyt的动态变化和[Ca2+]cyt升高的钙来源进行了研究。结果表明：抗叶锈小麦品种‘洛夫林10’的原生质体在激发子处理后,[Ca2+]cyt明显升高,随后有所下降,但在试验检测时间范围内仍保持较高浓度水平;而感病品种‘郑州5389’经激发子处理后,[Ca2+]cyt只发生轻微的波动。使用质膜钙通道抑制剂抑制胞外钙离子流入胞内,再经激发子处理,原生质体[Ca2+]cyt虽也有升高,但升高幅度大大降低。这一结果表明,激发子刺激诱发的[Ca2+]cyt升高主要源于胞外钙离子内流。     

激发子诱发的小麦叶肉细胞原生质体[Ca2+]cyt升高主要源于胞外钙离子内流

以小麦叶肉细胞原生质体-激发子互作为研究体系,借助共聚焦激光扫描显微镜观察结合药物学试验,对激发子刺激后不同抗叶锈性小麦品种原生质体[Ca2+]cyt的动态变化和[Ca2+]cyt升高的钙来源进行了研究。结果表明:抗叶锈小麦品种‘洛夫林10’的原生质体在激发子处理后,[Ca2+]cyt明显升高,随后有所下降,但在试验检测时间范围内仍保持较高浓度水平;而感病品种‘郑州5389’经激发子处理后,[Ca2+]cyt只发生轻微的波动。使用质膜钙通道抑制剂抑制胞外钙离子流入胞内,再经激发子处理,原生质体[Ca2+]cyt虽也有升高,但升高幅度大大降低。这一结果表明,激发子刺激诱发的[Ca2+]cyt升高主要源于胞外钙离子内流。     

激发子诱发小麦叶肉细胞原生质体微管骨架排列格局与[Ca2+]cyt的变化

以小麦叶肉细胞原生质体-激发子互作为研究体系,通过免疫荧光标记和Ca~(2 )荧光染料的装载并结合药理学试验,借助激光共聚焦扫描显微镜观察,探讨小麦抵抗叶锈菌侵染过程中微管骨架和Ca~(2 )之间的内在联系。试验结果表明,激发子处理可引起抗性品种原生质体[Ca~(2 )]_(cyt)的升高并诱发微管骨架的解聚,预解聚微管骨架,再用激发子处理,可使抗性品种原生质体[Ca~(2 )]_(cyt)的升高幅度增加。     

小麦原生质体高效转化体系的建立

植物原生质体广泛应用于植物基因功能研究中,包括瞬时基因表达、亚细胞定位、蛋白互作和蛋白活性分析等。当前,小麦基因的亚细胞定位和功能分析,大多利用模式植物拟南芥等异源的原生质体,易于造成研究结果的不准确。为避免这种情况,小麦原生质体制备及高效转化体系的建立与应用是必需的。在PEG介导的小麦原生质体转化过程中,原生质体分泌的核酸酶大量降解质粒DNA,转化效率的提高因此受到阻碍。为了建立小麦原生质体的高效转化体系,本文测试了抑制胞外核酸酶活性的因素和提高质粒DNA浓度等多个条件对转化效率的影响。结果表明,转化过程中加入双倍用量的质粒DNA进行转化,且始终保持低温环境(1℃)用以抑制核酸酶酶活性,可以使小麦原生质体的转化效率提高至85%。本文还将该系统成功地应用于2个小麦抗病相关蛋白的亚细胞定位研究,证明了该系统的高效性和实用性。该研究对未来相关研究有一定参考价值。     

接种叶锈菌的小麦叶片胞间洗脱液对叶肉细胞原生质体微丝骨架的影响

用异硫氰酸 鬼笔环肽 (FITC Ph)标记和共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM )观察发现 ,以具有激发子活性的接种叶锈菌的小麦叶片的胞间洗脱液 (IWF)处理叶肉细胞原生质体一定时间后 ,抗病小麦品种洛夫林 10的原生质体内微丝骨架保持完整的网络状结构 ,而感病品种 5 389的大部分微丝骨架处于解聚状态。同时 ,抗病品种因IWF处理诱发的防卫反应———H2 O2 突发和HR反应的程度 (用原生质体活力下降的程度表示 )也大大高于感病品种。用细胞松弛素D(CD)预处理抗病品种原生质体可以明显抑制IWF处理诱发的H2 O2突发和HR反应 ,表明微丝骨架的状态可能与抗病性有密切的关系 ,完整的微丝骨架是H2 O2 突发和HR反应的一个重要条件。     

植物原生质体的游离和融合

通过原生质体融合进行体细胞杂交已或为研究植物遗传和育种的一个潜在新途径。在本报道中,我们描述了用酶法将小麦、大麦、玉米、红花和蚕豆等作物的叶片和根尖细胞游离成大量的完整的原生质体的方法。观察了在降低原生质体悬浮液的渗透浓度下,小麦、玉米及蚕豆的同源融合的过程。这种融合过程可在数分钟内完成。在上述植物中以小麦和玉米的同源融合率较高,分别达到15％和22％。还描述了获得诱发种间融合的方法。利用硝酸钠和降低渗透稳定剂浓度时,于蚕豆叶片和红花根尖的远缘种间原生质体间获得了融合体。诱发融合率达4％强。同时也观察到小麦叶片和红花根尖原生质体间的融合。     

普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化

以7日龄小麦幼苗的叶肉细胞为材料,采用正交试验分析了纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解时间、甘露醇浓度对原生质体分离时的产量和活力的影响;采用瞬时表达技术通过PEG-Ca~(2+)介导法转化小麦的原生质体,分析了PEG浓度对转化效率的影响。结果表明,小麦叶片原生质体分离的最佳条件为纤维素酶1.5%,离析酶0.75%,甘露醇0.4 mol/L,酶解时间3 h,得到的原生质体的产量可达到7.2×10~6个/g·FW,活力超过95%;瞬时表达实验结果表明,在25%PEG浓度下,小麦原生质体的转化效率最高。     

高粱品种BTx623原生质体分离及瞬时表达体系的建立

高粱(Sorghum bicolor)是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大麦的重要粮食作物之一,虽然高粱基因组已经完成了测序,但是针对高粱测序品种BTx623,遗传转化方法的缺乏限制了高粱遗传育种和功能基因组研究的发展。而原生质体瞬时表达技术,则因为其高效、快速的特性,在功能基因组研究中具有重要的作用。为了在高粱品种BTx623中建立原生质体瞬时表达体系,本研究以BTx623幼苗为材料,对原生质体分离过程中的渗透压、酶液成分、酶解时间进行研究。结果表明:BTx623幼苗的原生质体分离过程中,最佳酶解液组成为1%纤维素酶、0. 25%离析酶、0. 6 mol/L甘露醇、10 mmol/L吗啉乙烷磺酸、1mmol/L CaCl_2、0. 1%小牛血清蛋白和5 mmol/Lβ-巯基乙醇,并获得了每毫升1×107个的高质量原生质体,所获原生质体活性在90%以上。之后利用PEG介导的转化方法,将含有35S::egfp的质粒导入到原生质体中,并通过荧光显微观察统计,遗传转化率达到(61. 31±3. 91)%。本研究通过优化高粱品种BTx623原生质体制备及瞬时转化的条件,成功建立了其原生质体瞬时表达体系,为进一步开展高粱品种BTx623功能基因组的研究奠定了基础。     

小麦与燕麦不对称体细胞杂交的研究

以小麦品种济南177的悬浮细胞系(长期继代培养已丧失分化能力)来源的原生质体混合同品种胚性愈伤组织(分化能力较强, 约70%)制备的原生质体为受体, 以经300 mW/cm²紫外线照射0.5, 1, 2, 3, 5 min的普通燕麦愈伤组织(分化频率很低, 约10%)原生质体作供体, 用PEG法诱导融合. 可高频率地获得体细胞杂种细胞系, 并分化获得绿色正常的再生植株, 经荧光原位杂交、 同工酶及5S rDNA间隔序列分析, 确认了它们为体细胞杂种. 单独使用小麦胚性悬浮系或愈伤组织为受体获得的杂种克隆均未能得到绿色植株.     

普通小麦与簇毛麦原生质体的紫外线融合

从来源于普通小麦品种济南177（Triticum aestivum cv.Jinan 177）悬浮细胞系的原生质体与来源于簇毛麦（Haynaldia villosa）胚性愈伤组织的原生质体融合获得体细胞杂种。供体簇毛麦原生质体在融合之前用紫外线照射30s或1min,紫外线剂量为360Цw/cm^2。仅由紫外线照射30s的组合获得再生愈伤组织克隆。细胞学、生物化学及PCR分析结果证实了再生克隆的杂种性质。用线粒体基因特异的探针进行的RFLP分析的结果表明,杂种中含有融合双亲的线粒体并且发生了重组。由杂种愈伤组织再生得到白化苗。讨论了紫外线对融合产物的影响。     

不同染色体组小麦种叶片原生质体的特点和光合速率的比较

ABD染色体组中国春小麦叶片原生质体的大小及其中叶绿体数目均大于野生一粒小麦(A染色体组)和粗山羊草(D染色体组小麦)。但在这三个种中,原生质体光合速率以野生一粒小麦为最高;粗山羊草叶片一生中的光合速率在高水平上的持续时间最长,且其离体原生质体保存期间的光合速率下降最慢。     

玉米、小麦、水稻原生质体制备条件优化

玉米Zea mays L.、小麦Triticum aestivum L.、水稻Oryza sativaL.是三大重要粮食作物,对其原生质体制备条件的优化具有重要意义.以玉米(综3)、小麦(中国春)、水稻(日本晴)10日龄幼苗为材料,研究了叶肉细胞原生质体分离过程中的酶浓度、酶解时间和离心力大小等因素对产量和活力的影响.结果表明:酶浓度和酶解时间对原生质体产量影响显著,随着酶解液浓度和酶解时间的提高,原生质体产量增加,但细胞碎片同时增多.水稻经真空处理后,原生质体产量大幅度提高.通过正交实验设计得出如下结果:玉米叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解7h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为7×106/g FW;小麦叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解5h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为6×106/g FW;水稻叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶2.0％,离析酶0.7％,50 r/min酶解7h,1 000×g离心2 min收集,得到的原生质体产量为6×106/g FW.通过二乙酸荧光素染色发现原生质体活力均在90％以上.用PEG-Ca2+介导法将含有绿色荧光蛋白的质粒转化入原生质体,转化率可达50％ ～80％.     

混合小麦亲本与新麦草不对称体细胞杂交体系的建立

以小麦品种济南177悬浮细胞系来源的原生质体与同品系胚性愈伤组织制备的原生质体混合后作为受体;以经过380μＷ/ｃｍ²紫外线照射1min、2min的新麦草原生质体分别作为供体,用PEG法诱导融合。组合Ⅰ(176+cha9+新麦草UV 1min)获得16个再生克隆。经过形态学、同工酶、染色体和RAPD分析,确定其全部为属间体细胞杂种。其中的5个克隆再生杂种植株。用7对小麦SSR引物对杂种克隆的叶绿体基因组进行了分析;组合Ⅱ(176+cha9+新麦草UV 2min)只获得3个克隆,且逐渐褐化死亡。表明以小麦济南177的两种培养细胞混合作受体的融合体系有利于杂种的获得及再生;紫外线对融合产物的生长发育有明显的剂量效应。     

烟草叶肉细胞原生质体培养成植株的研究

应用自制的纤维素酶从三个烟草品种的叶肉组织获得大量完整的有活力的原生质体,阐述了影响原生质体活力的某些因素。详细叙述了烟草原生质体的培养过程和方法,由于培养技术的改进,试验所用三个烟草品种的叶肉原生质体已经生长分裂形成愈伤组织,并分化成再生植株。此外,观察到“金星”的双倍体与单倍体叶肉原生质体在同一培养基上生长的差异。并对自制纤维素酶与日本纤维素酶(Onozuka)进行了比较。讨论了烟草原生质体从体积增大到细胞分裂形成愈伤组织过程中必须移贴的原因。     

植物原生质体培养研究进展及应用

综述了原生质体培养的研究进展。原生质体培养在理论研究上的应用有３个方面：（１）细胞生理现象的研究;（２）细胞与细胞质相互关系的研究;（３）病毒侵染与复制机理的研究。在原生质体培养中可通过遗传操作和突变体的筛选对品种进行改良,创造优异品种。     

单倍体小麦与羊草的属间体细胞杂交

以失去植株再生能力的小麦单倍体愈伤组织和羊草二倍体愈伤组织为材料,游离原生质体,并用紫外线自理２羊草原生质体,用ＰＥＧ法融合,对融合克隆进行染色体和同工酶分析,在已贩２６个克隆中有２１个是杂种,其中有一个克隆再生出短命小植株,结果 体小麦与二倍体草的不对称融合虽然再生互补效应不如二倍体小麦,然而杂种优先生长的现象仍然比较明显。如果改善实验条件和双亲原始的再生能力,这种融合方式仍然可以利用。     

固氮作用

871702 引导固氮蓝细菌进人植物和真菌原生质体的研究[会,中]/陈廷伟…//第一届农业生物技术学术讨论会资料(上海)-1986 报道了以PEG引导植物(小麦、水稻、玉米、烟草、大白菜、绿豆)和真菌链抱霉原生质体摄取固氮蓝细菌Gloeocapsa的结果。     

小麦叶肉原生质体在马铃薯简化培养基上的分裂

近年来,在小麦、水稻花药培养的研究中, 使用了马铃薯简化培养基,已取得很大成 效^[1-3]。我们在大麦、小麦叶肉原生质体培养的 研究中,为了寻找能促使其再生细胞进行连续 的细胞分裂,除了采用各种合成培养基外,也使 用了马铃薯培养基。本文简要报道小麦叶肉原 生质体在马铃薯简化培养基中能有规则地进行 有限的几次细胞分裂的结果