黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs和Drs-lC 的原核可溶性表达及抗真菌活性测定

Drosomycin （Drs）是第1个从黑腹果蝇Drosophila melanogaster体内鉴定发现的昆 虫抗真菌肽因子。它对细菌无明显的抗性,但对丝状真菌具有高效广谱的抑杀作用。此外, 在黑腹果蝇基因组还存在着Drs的另外6个同系物的基因序列,其中同系物Drosomycin-lC（Drs-lC）的抗真菌谱仅次于Drs。将Drs抗真菌肽基因(Drs)和同系物Drs-lC基因（Drs-lC）进行可溶性表达,对果蔬等农产品防腐保鲜的研究有应用前景。本实验将Drs和Drs-lC分别克隆到硫氧还蛋白（Trx）融合表达载体pThiohis A中,转化宿主菌TOP10,进行可溶性表达,并从诱导表达的菌液起始浓度、IPTG的诱导浓度及诱导时间等方面进行了表达条件的优化。结果表明2种融合蛋白Trx-Drs和Trx-Drs-lC大部分以可溶形式表达,可溶性表达的Trx-Drs在上清液中约占菌体总蛋白的22％。2种融合蛋白的表达产物经 Ni-NTA亲和层析得到纯化。生测结果表明, 2种融合蛋白分别对8种供试真菌中的5种真菌显示明显的抗性。     

CpG基序重组菌发酵培养基的优化

目的:为提高CpG基序重组菌的发酵水平,降低CpG重组质粒的生产成本,运用响应面法优化CpG重组菌发酵培养基。方法:利用Plackett-Burman试验筛选出影响发酵水平的3个最显著因素:糖蜜、玉米浆和工业蛋白胨。然后用响应面设计试验并优化得到最显著因素的最佳浓度,并进一步通过发酵试验验证优化后的培养基。结果:得到一组具有较高菌浓及质粒产量且价格低廉的发酵用培养基:糖蜜4.5g/L,玉米浆8.5g/L,工业蛋白胨8.5g/L,甘油10mL/L,KH2PO41.5g/L,K2HPO42.3g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L,在此培养条件下,OD600实测值为0.6771,理论值为0.6643,两者接近,与标准LB培养基相比,质粒产量提高了15%左右。结论:最终筛选到的培养基具有较高的性价比。     

家蚕拟抗微生物肽Gloverins基因（Bmglv）的原核表达及抗菌活性鉴定

家蚕Bombyx mori基因组全测序于2004年完成后,由家蚕基因组注释发现了35条拟抗微生物肽基因序列。本研究选取其中的5条Gloverins同系物（isoforms）基因(BmglvB,BmglvA2 ,BmglvA3,BmglvA5和BmglvA6 ),克隆至pET-21d载体,转化Escherichia coli Rosetta^TM（DE3）宿主菌进行表达;克隆表达的5个家蚕Gloverins同系物基因大部分以可溶形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化和Sephadex G-10脱盐处理后,采用平板孔穴抑菌法测定其抗菌活性。结果表明：注释发现的5条家蚕拟抗微生物肽Gloverins同系物基因,具有与在其他昆虫中已鉴定报道的Gloverin相似的抗革兰氏阴性细菌的功能,实验确认了它们就是家蚕Gloverins抗微生物肽基因。     

转基因RNAi技术在动物抗病毒育种中的应用

病毒对动物和人类健康都是极大的威胁,抗病毒疫苗虽然能在一定程度上预防病毒病,但目前几乎还不能对变异的传染病进行抗病毒治疗。尽管RNA干扰研究到目前才短短十几年,其作用机理已基本清楚。RNAi能够非常有效的抑制病毒体内复制,其介导的抗病转基因动物的研究相继取得了阶段性进展,抗疯牛病转基因羊和牛,抗内源性逆转录病毒猪以及抗核型多角体病毒病的转基因家蚕已经成功获得。尽管如此,目前的研究主要还是集中在细胞水平及小鼠模型方面,获得的转基因动物种类和数量有限,但为培育动物抗病毒品种提供了理论依据和技术支撑。随着转基因技术的不断的进步和成熟, RNA干扰技术将成为动物抗病毒育种中最有应用前景的方法之一。     

甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析同步检测

目的:探讨建立一种同时快速检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)两种肿瘤标志物的方法.方法:用胶体金分别标记鼠抗AFP单克隆抗体和鼠抗CEA单克隆抗体,喷于胶金垫上.与之配对的抗体喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上分别做检测线T2和T1,兔抗鼠二抗喷在NC膜上做质控线,利用免疫层析技术进行检测.结果:采用Frens方法制备的胶体金粒径在20nm,紫外可见吸收峰在521 nm处,金标抗体的最适pH在9.0,最适抗体量为200μl,胶体金标记2.4μg抗体.测试结果表明同时检测AFP和CEA的试纸条灵敏度分别为20 ng.mL-1和5 ng.mL-1,检测时间仅需10min,与PSA、CA125、CA15-3、Ferritin、Human Albumin等没有交叉反应,稳定性好.结论:应用胶体金免疫层析技术,实现了AFP和CEA的同步检测.