人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

抗甲型肝炎病毒单克隆抗体的研究

我们于1984年开展研究抗甲型肝炎病毒(HBV)的单克隆抗体(McAb),得到了3株能连续传代,稳定分泌抗-HAAg的杂交瘤细胞系,抗体在组织培养上清液中的ELISA滴度为1:800～1:1600,腹水为1:10,000—1:100,000。 用ELISA方法检测三株杂交瘤细胞分泌的抗体与经免疫粘附血凝(IAHA),免疫电镜(IEM)证实的5份甲肝抗原和Abbott公司的甲肝抗原均产生特异性反应。但不与正常人     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备

目的:制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法:以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体,并对其进行特异性鉴定,建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果:获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。结论:成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法,为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。     

棉铃虫类肌钙蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

利用蛋白免疫法制备鼠抗棉铃虫类肌钙蛋白(Helicoverpa armigera Calponin,Ha Cal)的多克隆抗体并进行初步应用。通过原核表达棉铃虫类肌钙蛋白,镍柱纯化获得目的蛋白,经足垫加皮下注射免疫小鼠,4次免疫后用ELISA检测法确定鼠抗Ha Cal蛋白多克隆抗体的效价。通过Western blot和免疫组化检测该多克隆抗体免疫特异性。蛋白免疫法制备的鼠抗Ha Cal多克隆抗体滴度高于1∶819 200。Western-blot和免疫组化显示该抗体能特异性识别棉铃虫体内的天然Ha Cal蛋白。利用蛋白免疫法制备获得了效价高且特异性强的鼠抗棉铃虫Ha Cal多克隆抗体,旨为进一步研究棉铃虫Ha Cal蛋白表达特性及其抗药性功能提供重要的实验工具。     

抗汉坦病毒等三种单克隆抗体细胞株的建立及分析应用

以纯化的病毒抗原加完全福氏佐剂,免疫BALB/c小鼠,再利用杂交瘤技术建立针对汉坦病毒、狂犬病毒及乙型脑炎病毒的单克隆抗体(McAb)细胞株,制备并提纯标记McAb,应用于各种实验和检测工作。结果获得了6株分泌抗汉坦病毒McAb杂交瘤细胞株、6株分泌抗狂犬病毒McAb杂交瘤细胞株、2株分泌抗乙型脑炎病毒McAb杂交瘤细胞株,共14株,并对它们的特性进行了分析。各McAb效价不尽相同,有的高达10-7,有的则不足10-3。各McAb亚型以IgG型为主,少数为IgM型;轻链以κ型为主,个别为λ型或阴性。McAb与纯化的病毒抗原有明显的特异性吸附(P<0.01)。有的McAb有相同的作用位点,有的McAb则没有,但与其它McAb有交叉反应。通过对McAb进行提纯和标记,建立了双抗体夹心ELISA法,用于病毒抗原的检测。实验表明获得的McAb有较好的生物学特性,可与相应的病毒抗原特异性结合,用于免疫学检测及其它多种用途。     

人生长分化因子15单克隆抗体制备、鉴定及药用价值初探

目的:制备稳定分泌抗人生长分化因子15(GDF15)单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的m Ab进行鉴定。方法:根据人GDF15氨基酸序列特征,设计合成了8条能够免疫产生GDF15特异性抗体的抗原多肽,与VLP载体偶联后,免疫雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备鼠源抗人GDF15的m Ab,用间接ELISA检测m Ab腹水效价。结果:获得针对7个抗原多肽的12株稳定分泌抗人GDF15的杂交瘤细胞系,腹水m Ab效价可达1×104~1×109。结论:获得了针对不同抗原多肽的抗人GDF15的特异性m Ab,为进一步研发以GDF15为靶点的单克隆抗体抗肿瘤药物奠定了基础。     

单克隆抗体与抗血清联合应用建立血清CMLC测定方法的研究

单克隆抗体(McAb)和抗血清各有特点。本文提纯人心肌肌球蛋白轻链(CMLC)并制备其单克隆抗体和抗CMLC兔血清(下称抗血清),试建立测定血清CMLC的酶联免疫(ELISA)方法。通过比较,McAb和抗血清联合应用可提高测定方法的灵敏度和特异性;并对各反应试剂的工作浓度进行确定,建立了McAb(1C_(11)-D_7株)为铺底抗体,抗血清为覆盖抗体,碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG为第三抗体的三抗体酶联免疫夹心测定血清CMLC的方法(MP-ELISA)。血清CMLC最小可测浓度为2.5ng/mL。     

基于N蛋白单克隆抗体的小反刍兽疫病毒抗体检测胶体金试纸条的研制

本研究旨在建立一种简便、快捷、可直观检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的检测方法。将pET-32a-N重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,以纯化的PPRVN蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)筛选及亚克隆,获得了抗PPRV N蛋白的单克隆抗体。将PPRV N蛋白分别作为金标抗原及检测线(T线)包被抗原、单克隆抗体作为质控线(C线)包被抗体,组装成检测PPRVN蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条。结果显示：成功获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为1F1;间接ELISA检测1F1腹水效价为1:128000;亚类鉴定结果为IgG1,轻链为kappa链。Westernblotting结果显示,1F1能与PPRV N蛋白特异性结合;间接免疫荧光(indirect immunofluorescent ass...     

神经元特异性烯醇酶和癌胚抗原胶体金免疫层析联合检测

目的:应用双抗夹心胶体金免疫层析方法,实现对神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)两种肺癌肿瘤标志物的快速联合检测。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒,并分别对鼠抗NSE、CEA单克隆抗体进行标记,分别与之相配对的另一种单克隆抗体被喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上,制成免疫层析检测试条。溶液中的抗原NSE、CEA与金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上固定的抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果:该试纸条只与NSE、CEA有特异性反应,与CA125、CYFRA21-1、TPA等肺癌标志物无交叉反应。标准样品中两种抗原的检测灵敏度分别可达到5ng/mL和3ng/mL。结论:胶体金免疫层析技术检测NSE、CEA特异性强、灵敏度高、简便快速,不需特殊仪器设备,有广泛应用价值。