大鼠睾丸发育过程中促甲状腺激素释放激素受体mRNA的表达

为研究促甲状腺激素释放激素受体(TRHR)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用,依据大鼠垂体中的TRH-RcDNA设计引物,采用RT-PCR法从大鼠睾丸组织中获得了TRH-R的cDNA克隆,测序表明其核苷酸序列与大鼠垂体中的TRH-RcDNA序列完全一致.应用非放射性原位杂交(NR-ISH)技术观察TRH-RmRNA在大鼠睾丸中的定位,结果显示杂交信号集中在间质细胞中,生精细胞无杂交信号.利用实时动态定量RT-PCR法观察了TRH-R在不同发育阶段大鼠睾丸中的表达变化,发现在睾丸间质细胞发育的初期阶段(第8天),没有TRH-R的表达,但从第15天起能观察到TRH-R的表达,并且表达量在20天、35天、60天、90天逐渐增加.这些结果表明,大鼠睾丸组织间质细胞能特异性表达TRH-R,并且表达量与发育过程相关.     

促甲状腺激素释放激素受体mRNA在大鼠睾丸中的表达(英文)

本应用原位杂交技术在大鼠睾丸恒冷箱切片上研究了促甲状腺激素释放激素受体（TRH－R）RNA的表达和定位。由DNA合成仪合成两个含48个碱基的寡核苷酸探针,两个探针分别与小鼠垂体TRH－R1005－1052和1332－1379区段的cDNA互补,生物素在5′末端标记寡核苷酸探针。结果显示TRH－R寡核苷酸探针与其互补的mRNA杂交信号集中在大鼠睾丸的间质细胞中,生精细胞地交信号,杂交信号的强度依探针浓度而增加,该结果表明RTH可能通过自分泌调节生殖功能和发育,TRH－R作用途径可能与在垂体的作用类似。     

雄激素受体在大鼠睾丸中转录模式的分析

目的：研究Ar（雄激素受体）基因在大鼠睾丸组织中的转录模式。方法：取刚出生的雄性Wistar大鼠,于出生2~65日的不同时间点,脊椎脱臼处死3只不同窝别的幼鼠,提取睾丸组织总mRNA;将mRNA反转录成cDNA,随后采用Real-time PCR方法检测大鼠睾丸组织中Ar mRNA的转录情况。结果：Ar mRNA表达在出生后第2天开始缓慢上升到第16天达到最高值,第16天到第30天迅速下降,第31天出现一个小高峰后到第65天持续缓慢下降。结论：Ar基因在大鼠早期发育睾丸组织中表达量逐渐升高,可能与精原干细胞的增殖及初级精母细胞的发生相关。     

中心体蛋白Cenexin在大鼠精子发生过程中的表达特征

中心体蛋白Cenexin是成熟中心粒的唯一标志分子。为阐明中心粒在大鼠精子发生中的成熟以及功能,我们首先通过RT－PCR技术从大鼠睾丸组织中扩增出了Cenexin cDNA片段,原核表达重组蛋白后,用其免疫小鼠制备了高滴度的抗Cenexin的多克隆抗体,然后利用免疫荧光染色、Western Blot和半定量RT－PCR方法,研究了大鼠精子发生过程中Cenexin蛋白和基因的表达特征。结果显示Cenexin mRNA水平在精原细胞和精母细胞中较高,随后表达水平下降,而蛋白质分子在精原细胞到精子细胞中都定位于细胞的一个中心粒上,表示有成熟中心粒的存在,在长形精子细胞中该蛋白位于鞭毛的基体部。附睾的绝大多数成熟精子中Cenexin免疫染色消失。中心体蛋白Cenexin在精子变态期的表达变化可能与精子鞭毛形成的起始有关。     

Smad4蛋白在不同龄大鼠睾丸的定位研究

探讨转化生长因子－β超家族肽类的细胞内信号转导分子Smad4蛋白在发育不同阶段大鼠睾丸的表达与分布。分别选用出生后3、7、14、28天以及成年大鼠,应用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶－DAB－硫酸镍铵增强技术及蛋白质免疫印迹技术,检测Smad4蛋白在大鼠睾丸的表达、定位和发育变化,并通过图像分析技术对免疫组织化学结果进行统计学分析。结果显示,发育各个阶段的间质细胞中都有较强的表达,免疫阳性产物位于细胞质内,而各级生精细胞则无阳性反应,且随着大鼠睾丸发育阶段的变化而蛋白表达量逐渐增多,为TGF－β超家族成员在精子发生和发育过程中的分子机理提供了直接证据。     

牛性别决定新基因Fgf9的克隆及生物信息学分析

Fgf9基因是脊椎动物性别决定中重要的信号因子,它在睾丸发育过程中参与Sertoli细胞的增殖和睾丸索的形成。基于表达序列标签（expressed sequence tags, ESTs）克隆原理,采用序列拼接和 RTPCR方法获得了荷斯坦奶牛Fgf9基因的cDNA序列,并对其组织表达特征进行分析。利用生物信息学方法对Fgf9基因序列和蛋白结构进行分析。结果显示：Fgf9基因定位于牛12号染色体上,cDNA全长为697bp,开放阅读框为627bp,编码208个氨基酸,分子量23.38245kDa,等电点7.0600。RTPCR证实该开放阅读框正确,在牛的各组织中均有表达,且与牛其他cDNA无同源性,获得GenBank登陆号为：EU693028。功能结构分析显示Fgf9蛋白具有典型的FGF家族保守结构域,包括受体相互作用位点和肝素结合位点。信号肽预测显示牛Fgf9蛋白可能不存在信号肽序列。
学     

大鼠脑红蛋白基因编码区的克隆、多态性分析及该基因组织表达谱研究

参考人和小鼠脑红蛋白（Neuroglobin,NGB)的cDNA序列设计简并引物,用RT－PCR方法从大鼠脑组织中扩增出大鼠NGB基因编码区的cDNA序列,该序列与小鼠NGB基因编码区的序列同尖性为96％,与人NGB基因编码区的序列同源性为88％,进一步分析表明,大鼠NGB基因编码区存在多个多态性位点;113t/c[138P],133a/g[N45D],388a/g[R130G],417t/c.该序列已被GenBank接受,登录号为AF333245,RT－PCR分析表明,该基因在大鼠脑,肝,肾,心肌和骨骼肌中均有较高水平表达,提示了其功能上的重要性。     

促甲状腺激素释放激素受体-1(TRH-R1)蛋白在大鼠出生后睾丸不同发育阶段的表达和定位

目的研究促甲状腺激素释放激素受体-1(thyrotrophin-releasing hormone receptor type-1, TRH-R1)在大鼠睾丸出生后不同发育阶段的表达,探讨其在生殖发育调节中的作用.方法应用蛋白质免疫印迹杂交技术以及免疫组织化学ABC法检测TRH-R1在8d、15d、20d、35d、60d和90d大鼠睾丸中的表达和定位,并结合图像分析技术对免疫组化结果进行统计学分析观察其在发育过程中的变化.结果免疫印迹杂交发现TRH-R1蛋白表达于15d以后各阶段的大鼠睾丸;而运用免疫组化在第8d即检测到TRH-R1的表达,以后发育过程中的各个阶段均有阳性反应细胞, TRH-R1定位于大鼠睾丸的间质细胞;免疫反应阳性物均位于胞膜和胞质,胞核区为阴性;图像分析结果表明,随着大鼠睾丸的发育,TRH-R1表达量呈增多趋势,且具有统计学差异(P＜0.01).结论本实验证明TRH-R1在出生后8d大鼠的睾丸内即有表达,并持续表达于其后各个发育阶段;TRH-R1定位于睾丸的间质细胞,其表达量随着增龄变化呈增多趋势,即同发育过程相关.     

小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因SRG2的分子克隆

从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段 (BE6 4 4 5 4 2 )入手 ,利用网上生物信息学克隆了该基因全长 ,GenBank登录号为AF395 0 83。从小鼠睾丸cDNA文库中分离出该基因完整阅读框cDNA ,SRG2基因的cDNA全长为 10 5 8bp ,编码由 2 95个氨基酸组成、分子量为 335 79、等电点为 9.6 4的蛋白质 ,与人类同源基因TSARG2相似性为 78% ,与已知蛋白质无明显同源性。RT PCR结果表明该基因只在睾丸中有高表达。     

实验性铅中毒对大鼠海马p75基因表达的影响

目的　探讨铅对海马 p75基因表达的影响。方法　采用RT PCR方法 ,半定量分析铅对大鼠海马组织NGFmRNA表达的变化。以地高辛标记的p75cDNA为探针 ,采用原位杂交方法观察铅对大鼠海马 p75mRNA表达的影响。结果　与对照组相比 ,大鼠以 1%醋酸铅经口染毒 8周 ,海马组织 p75mRNA的表达量明显下降 (P <0 0 1)。结论　铅可影响海马 p75基因的表达。     

重组截短型人源结缔组织生长因子在大肠杆菌中的表达

用RT－PCR法从人胎盘组织中克隆出人源结缔组织生长因子（h-CTGF)cDNA序列867bp,将此cDNA亚克隆至表达载体pET-9a,重组质粒转化BL21（DE3）pLysS,诱导出N端缺失61个氨基酸残基的截短型rh－CTGF,表达量占总菌体蛋白的7％,主要以不溶性包涵体形式存在,采用离心、洗涤和凝胶过滤分离纯化后,行活性检测表明截短型rt-CTGF无刺激增殖活性,并对用原核表达rt-CTGF作了讨论,为制备抗体、CTGF表达调控和功能研究打下了基础。     

人类新基因ACBP5cDNA的克隆及其同源物在小鼠/鸡胚发育过程中的表达

利用电子克隆的方法寻找具有重要结构域的人类新基因ACBP5 ,根据得到的序列信息用RT PCR的方法获得全长基因 .通过生物信息学方法预测其结构 ,采用整体原位杂交和组织RT PCR的实验方法 ,在小鼠和鸡胚胎实验模型中研究该基因在发育过程中的表达情况 ,并对其功能进行初步的预测 ,获得一个含有乙酰辅酶A结合蛋白 (acyl CoAbindingprotein ,ACBP)结构域的人类新基因ACBP5 .ACBP5基因的cDNA长度为 10 83bp ,生物信息学方法预测其定位在人第 1号染色体上 ,包含 7个外显子 ,6个内含子 ,包含一个 35 4bp的完整阅读框架 ,编码一个 118个氨基酸残基的蛋白 .在以小鼠胚胎和鸡胚为模型的整体原位杂交中 ,以ACBP5基因全长编码区为探针的结果均显示该基因在胚胎头部特异表达 ,并且主要集中在中脑与间脑之间的峡部 .成体小鼠的组织RT PCR的结果显示 ,ACBP5的同源基因在各组织中均有表达 .这提示ACBP5基因在不同物种中的表达可能比较保守 ,并与头部发育有密切关系 ,同时也对维持细胞的正常功能起到重要的作用 .     

Smads蛋白在大鼠睾丸发育不同阶段的表达和定位

探讨转化生长因子－β超家族肽类的细胞内信号转导分子Smads蛋白在发育不同阶段大鼠睾丸的表达及在精子发生中的作用机理。分别选用出生后3、7、14和28d以及成年大鼠,应用蛋白质免疫印迹杂交技术及免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶－DAB－硫酸镍铵增强技术,检测Smad1、Smad2、Smad4和Smad5蛋白在大鼠睾丸的表达、定位和发育变化,并通过图像分析技术对免疫组织化学结果进行统计学分析。免疫印迹杂交发现,Samd1、Smad2和Smad4在3、7、14和28d以及成年大鼠睾丸的生精细胞中即可见免疫阳性反应;Smad2和从7d起开始表达,免疫阳性产物位于各级生精细胞的胞质内;Smad4在发育的各个阶段的间质细胞中均有较强的表达;Smad5仅在28d和成年大鼠的间质细胞中有弱的表达。结果提示：Smads蛋白在睾丸中的分布不同,表达量存在差异,为揭示TGF－β超家族在粗子发生和发育过程中的分子机制提供了直接证据。     

山羊胎儿肝脏3β—羟基甾体脱氢酶／Δ^4—Δ^5异构酶（3β—HSD）cDNA的克隆

3β－羟基甾体脱氢酶／Δ^4-Δ^5异构酶（3β－HSD）是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶,且具有异构酶活性。3β－HSD催化3β－羟基甾体的脱氢及随后的Δ^5-3-甾酮产物的异构化反应,以产生α,β－非饱和酮,3β－HSD在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料,首次获得了山羊胎肝的3β－HSD的cDNA,并进行了3β－HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛,啮齿类的3β－HSD CDNA的高同源区设计引物,以2－3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板,经RT－PCR获得416 bp cDNA片段（Fig.a),然后以其为探针筛选胎羊肝λgt10cDNA文库最后获得3－端缺失的3β－HSD cDNA克隆,并推导了其氨基酸序列（Fig.s)。同源分析表明山羊胎肝3β－HSD的氨基酸序列与牛卵巢,人I型3β－HSD的同源性分别为96％,78％和73％（Fig.3),提取雌性胎羊,雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA,同时做RT－PCR,表明3β－HSD在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β－HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号（Fig.4)。     

中国鸭IFN—γ基因的克隆与表达

鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染鸭,是研究IFN－γ在机体自然感染过程中机体与病毒的相互作用和病毒的清除机制的良好动物模型。从PHA刺激后的鸭外周血单核细胞（PBMC）中提取RNA,通过RT－PCR获得鸭IFN－γ（DuIFN-γ）cDNA基因,构建DuIFN-γ真核表达质粒,转染COS－7细胞,经细胞病变效应（CPE）抑制分析和MTT法对重组DuIFN-γ滴度进行测定。实验表明,重组DuIFN-γ能够抑制VSV感染鸭胚成纤维细胞而产生的细胞病变效应。抗－DuIFN-γ抗体,能中和这种抗病毒活性。并且,GST－DuIFN-γ融合蛋白在大肠杆菌中得到表达和进一步纯化。     

喉癌相关基因LCRG1的克隆和表达分析

喉癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤。选用在mRNA差异显示研究中获得的在喉癌组织中表达显著下调且代表新基因的EST之一（AF10056）,设计引物进行cDNA文库筛选,得到一全长为3448bp的cDNA序列,其开放读码框编码288个氨基酸,与已知蛋白质无明显同源性,属一新发现的基因,GenBank接受号为AF268387。与GenBank数据库匹配分析,发现该基因包含6个外子,基因组RT－PCR显示有40％（12／30）的喉癌组织表达下调,RT－PCR显示有54．5％（6／11）其他肿瘤细胞系表达缺失。把该基因命名为喉癌相关基因（laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)。这提示LCRG1可能与喉癌的发生发展相关。     

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因的分子特性及功能

【目的】通过研究中华稻蝗Oxya chinensis几丁质脱乙酰基酶1 (chitin deacetylase 1, CDA1)基因的分子特性和生物学功能, 为新型农药靶标筛选提供理论基础。【方法】在中华稻蝗转录组数据库搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因片段, 用生物信息学方法对其进行同源比对分析并作聚类关系图; 利用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）获得该基因cDNA全长序列; 通过Real-time quantitative PCR(qPCR)方法检测OcCDA1在5龄若虫不同组织部位和不同发育时期的表达情况, 并采用RNAi技术研究OcCDA1在飞蝗生长发育中的功能。【结果】获得中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因全长cDNA,命名为OcCDA1（GenBank登录号：KP271171）。OcCDA1在前肠、体壁、后肠和脂肪体组织中高表达, 在5龄第1天表达量显著高于以后几天。RNAi结果显示, 注射该基因的dsRNA后, OcCDA1基因的表达量降低了93.3%。OcCDA1基因沉默后虫体出现进食减少、发育迟缓现象, 总死亡率达到95.2%,其中38.1%的试虫在蜕皮前死亡, 57.1%出现因蜕皮困难而死亡的表型。【结论】OcCDA1在中华稻蝗的发育中起着重要作用, 该基因沉默引起虫体进食减少和蜕皮异常从而导致死亡。     

一个新的睾丸特异表达基因的克隆及功能的初步分析

运用“数据库消减杂交”(digital differential display)方法来筛选人类睾丸特异表达新基因,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群。挑选其中一个克隆重叠群HS．326528进行多组织RT—PCR,初步获得该重叠群在人睾丸中有高表达。从该重叠群的IMAGE出发,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列,其全长1044bp,开放阅读框为214～529bp,定位于15q26．2,编码由105个氨基酸组成、分子量为11．7kD、等电点为10．09的一个碱性蛋白,该蛋白与已知蛋白无明显的同源性,克隆实验证明该基因的阅读框完全正确,RT—PCR和Northern blot显示该基因在人类睾丸中特异表达,实时PCR结果表明：该基因在成人睾丸中高表达,在精子中有中度表达,在胚胎睾丸中低表达,推测该基因与精子的生成有关,命名为SRG8(homo sapiens spermatogenesis—related gene 8)(GenBank登录号：AY489187),该基因编码的蛋白定位于细胞核。流式结果分析表明,SRG8基因能够促使HeLa细胞由S期向G2期的转变,从而加速细胞的分裂。这些结果表明SRG8基因可能在睾丸的发育及精子的形成过程中起重要的作用。     

17β—雌二醇下调血管平滑肌内皮素A型受体的表达

为进一步探讨雌激素对心血管的保护作用,实验在双侧卵巢去势大鼠模型和培养的血管平滑肌细胞（VSMCs)上,观察17β－雌二醇（E2）对血管反应性及VSMCs增殖的影响,以RT－PCR和Western blot检测内皮素受体（ETAR）的表达,结果显示：去势雌性大鼠血管对内皮素（ET－1）的反应性明显增高,ETAR特异性受体阻断剂BQ123能完全阻断ET－1对VSMCs增殖的影响,E2能明显抑制ET－1对VSMCs增殖的作用,RT－PCR结果显示E2能抑制ETAR mRNA的表达,Western blot进一步证实E2能抑制ETAR蛋白表达,E2受体阻断剂Tamoxifen能部分抑制ET－1对VSMCs的增殖及ETAR的mRNA和蛋白 的表达。以上结果提示;ET－1促VSMCs增殖的效应主要是由ETAR介导的,雌激素能通过下调ETAR来抑制ET－1对VSMCs 促增殖的作用和血管对ET－1的反应,且此作用与雌激素受体有关。     

精索静脉曲张对青春期大鼠睾丸中VEGF和Flt-1蛋白表达的影响

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flt-1蛋白在实验性左侧精索静脉曲张(ELV)大鼠睾丸中的表达和定位,探讨它们在精索静脉曲张(VC)致男性不育中的作用。方法建立青春期大鼠ELV模型,采用免疫组化法检测VEGF及Flt-1在ELV4周、8周组及相应对照组大鼠睾丸中的表达变化。结果 VEGF和Flt-1蛋白在大鼠睾丸中定位具有细胞特异性。VEGF蛋白表达于生精细胞、精子细胞发育中的顶体、Sertoli和Leydig细胞胞质内;Flt-1表达于精子细胞发育中的顶体及Leydig细胞胞质中。ELV4周组睾丸中VEGF蛋白的表达显著增加(P<0.01),8周时其表达量下降(P<0.01);ELV4周组与8周组睾丸中Flt-1蛋白的表达均比相应对照组下降(P<0.01),ELV8周组比4周组显著减少(P<0.01)。结论 ELV可影响青春期大鼠睾丸中VEGF和Flt-1蛋白的表达量,可能会影响精子的发生、发育,因而该变化可能是VC引起男性不育的原因之一。