结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2阻遏调控rv1057基因转录的研究

探讨结核分枝杆菌拟核结合蛋白Lsr2是否是rv1057基因转录的阻遏蛋白。利用凝胶阻滞迁移试验分析Lsr2在体外与rv1057启动子片段的特异性结合能力;通过lacZ报告基因和荧光定量PCR检测rv1057启动子区域的不同突变形式对转录的影响;启动转录的能力;通过蛋白质免疫印迹法检测目标基因rv1057的表达。统计学处理采用t检验。Lsr2结合rv1057启动子;Lsr2与已知的阻遏蛋白TrcR都能结合rv1057启动子;缺失Lsr2结合位点的rv1057启动子能够在结核分枝杆菌生长周期中持续启动rv1057基因的转录;野生型菌株H37Rv生长早期(24 h)lsr2基因转录水平较低,而在H37Rv生长中期(48 h)、后期(120 h)lsr2基因的相对表达量变化倍数显著提高,差异具有统计学意义(t值分别为24.44、16.86,P0.05);H37Rv菌株和lsr2基因缺失菌株中trcR基因在生长早期(24 h)的相对表达量显著高于生长中期(48 h)、生长后期(120 h)的trcR表达量,差异具有统计学意义(t值分别为6.79、10.16,P0.05)。Lsr2是rv1057基因转录的阻遏蛋白,Lsr2和TrcR均可调控rv1057基因的表达。Lsr2在结核分枝杆菌生长周期的中后期大量表达并阻遏rv1057的转录,TrcR则在结核分枝杆菌生长周期的早期阻遏rv1057的转录。     

检测不同毒力结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的影响及其Caspase-3和Bcl-2的表达

该文为探讨不同毒力的结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的调控作用及其机制。实验用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗BCG分别感染巨噬细胞RAW264.7株,同时设空白对照组,在感染后1,6,12,24 h,用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率,应用Western blot检测细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达。结果发现,结核分枝杆菌感染组的凋亡率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);BCG感染组凋亡率高于H37Rv感染组,在感染后1,12,24 h凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后其Caspase-3蛋白表达增高,结核分枝杆菌感染组的Caspase-3蛋白表达高于对照组:对照组相似文献   

结核分枝杆菌Rv3881c突变子的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原,以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用,有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法：将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达;由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达,使用Ni-柱进行快速纯化。结果：Western印迹表明,重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论：重组Rv3881c突变体具有较好的特异性,提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。     

定量蛋白质组学分析链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床分离株

[目的]发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)链霉素耐药相关的潜在菌体蛋白.[方法]以结核分枝杆菌临床分离链霉素敏感株01105和结核分枝杆菌H37Rv为对照,采用iTRAQ技术和生物信息学鉴定并相对定量结核分枝杆菌临床分离链霉素耐药株01108菌体蛋白,并通过WEGO功能注释聚类分析01108菌株差异表达蛋白的细胞组分、分子功能和生物进程.[结果]01108菌株分别与01105菌株和H37Rv菌株比较差异表达蛋白为194个和146个,01108菌株与01105菌株和H37Rv比较均差异表达蛋白121个(共同差异表达蛋白).差异表达蛋白理论相对分子量和等电点分布广泛,其生物进程主要参与中间代谢、呼吸作用和脂质代谢,分子功能主要为催化活性功能和结合功能.共同差异表达蛋白:7个核糖体蛋白(Rv2785c,Rv0056,Rv0641,Rv0652,Rv0701,Rv1630和Rv2442c)在01108菌株中表达下调;7个蛋白在01108菌株中显著差异表达(上调大于1.20倍或下调小于0.55倍),分别为巯基过氧化物酶(Rv1932)、酰基载体蛋白脱氢酶(Rv0824c)、30S核糖体蛋白S15 (Rv2785c)、丙酮酸脱氢酶E2部分(Rv2215)、双组份转录调控蛋白(Rv3133c)以及假定未知蛋白(Rv2466c和Rv2626c).[结论]iTRAQ发现了链霉素耐药结核分枝杆菌相对于链霉素敏感结核分枝杆菌和H37Rv共同差异表达蛋白,为进一步探讨结核分枝杆菌链霉素耐药机制奠定了基础.     

利用表型芯片系统高通量分析H37Ra与H37Rv差异表型

H37Rv是结核分枝杆菌标准有毒株,H37Ra是从H37Rv获得的稳定减毒株,但目前H37Ra毒力减弱原因尚不完全清楚。本研究利用表型芯片系统,高通量分析H37Ra生长表型,并与H37Rv表型比较,筛选两菌株表型差异,分析与H37Ra毒力减弱可能的相关表型及分子机制。结果发现,与H37Rv相比,H37Ra耐酸及耐渗透压能力显著下降,且不能利用丁二酸单甲酯和吐温40作为碳源。结核分枝杆菌耐酸能力直接影响其在吞噬体中的生存和代谢,耐高渗能力影响其必需营养物质的跨膜运输,代谢途径的改变影响其在宿主内的能量摄取,三者改变均可能与H37Ra毒力减弱相关。     

结核分枝杆菌Rv1057基因对巨噬细胞感染早期细胞因子表达的影响分析

Rv1057是结核分枝杆菌中唯一的7-折叠片β-螺旋蛋白,其生物学功能尚不清楚。为探讨Rv1057基因在结核分枝杆菌感染初期对巨噬细胞免疫应答的影响,利用Rv1057基因缺失菌株D1057和野生型H37Rv菌株感染巨噬细胞,检测结核分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖速度,分析巨噬细胞在感染初期的细胞因子表达量变化。研究结果表明:D1057菌株在巨噬细胞内的活菌数量和增殖速度都显著低于H37Rv,被D1057感染的巨噬细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ表达量显著降低,但IL-8大量表达且无显著差异。上述研究结果证实,缺失Rv1057会降低结核分枝杆菌刺激巨噬细胞产生某些细胞因子的能力,明确了Rv1057基因参与结核分枝杆菌与巨噬细胞之间的免疫应答,为进一步解析Rv1057基因的生物学功能、结核分枝杆菌的致病机制奠定了基础。     

直肠接种卡介苗可诱导出与注射接种相似的免疫应答和保护作用

本文通过直肠途径接种卡介苗(BCG),并与肠胃外途径接种进行比较对结核分枝杆菌(结核杆菌)的免疫应答及保护作用.实验选用动物为BALB/c小鼠、远交系Hartley豚鼠和恒河猴;BCG为Pasteur株1173P2;攻击用菌种为结核杆菌H37Rv.直肠免疫小鼠、豚鼠及恒河猴时分别接种2×109、2×1010和6×1010活菌单位的BCG;皮下注射免疫小鼠时接种100 μl BCG(含108活菌单位);皮内注射免疫豚鼠和恒河猴时分别接种5×106和1×109活菌单位的BCG.在两条途径免疫后不同时间,取豚鼠和恒河猴脾细胞在96孔微孔板培养,用3H TdR掺入法测定对PPD刺激的增殖反应.     

结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化

Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的生物学功能奠定基础。前期实验发现构建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表达载体均无法实现目的蛋白的诱导表达。但经密码子优化后,仅有pMAL-c2X-Rv2742载体能够实现目的蛋白的可溶性诱导表达。此外,通过比较不同宿主菌、温度及IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响,发现目的蛋白在Rosetta (DE3)中,16℃及0.5mmol/LIPTG诱导条件下表达量最高。直链淀粉树脂(Amyloseresin)亲和层析柱纯化获得较纯的产物,经LC-MS/MS验证确认是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功获得结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742的重组蛋白,可进一步开展其潜在相互作用及免疫原性研究工作。     

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌(M．tuberculosis)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗(BCG)的各细胞组分,通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10~6CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞,体外抗原刺激,用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ干扰素(IFN-γ)分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠,并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞,都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应,可作为抗结核疫苗的候选抗原。     

多重PCR方法特异性鉴定卡介苗菌株多糖核酸的初探

与结核分枝杆菌H37Rv菌株进行比较,BCG菌株可找到一个特殊的缺失片段RD1,它存在于所有有毒分枝杆菌中,而在所有的卡介苗菌株中均缺失。应用多重PCR方法检测RD1区的存在与否,可以区别BCG和其它有毒的分枝杆菌。卡介菌多糖核酸来源于卡介菌,检测成品中DNA是否含有RD1区,能特异性地鉴别该制品。结果显示牛分枝杆菌标准株和结核分枝杆菌H37Rv存在RD1区;而卡介菌多糖核酸注射液和国内皮内注射用BCG疫苗生产用菌株扩增产物一致,提示均缺失RD1区。因此,这种多重PCR方法适用于卡介菌多糖核酸注射液的特异性鉴别试验。     

结核分枝杆菌Rv3871抗原优势肽段的克隆表达及抗原性鉴定

目的:为了提高结核病诊断试剂的特异性和敏感性,克隆表达结核分枝杆菌H37Rv株RD1区Rv3871抗原优势肽段,并应用ELISA法对其抗原性进行初步鉴定。方法:利用Biosun生物信息学软件对Rv3871抗原进行表位分析,通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3871抗原优势肽段编码基因,在大肠杆菌HB101中进行表达,采用间接ELISA法初步评价其抗原性。结果:Rv3871-1肽段检测的敏感性为32.5%(13/40),特异性为97.2%(35/36);Rv3871-2敏感性为45%(18/40),特异性为100%;Rv3871-3敏感性为37.5%(15/40),特异性为91.6%。结论:结核分枝杆菌RD1区Rv3871抗原优势肽段Rv3871-2有较高的特异性和敏感性,有望作为候选抗原用于结核病患者的血清学检测。     

布鲁氏菌变态反应原的研究Ⅴ.犬种菌的变态反应原性

我们按照规程要求制备了犬种菌素。它在致敏豚鼠和人体中证明了:它虽为粗糙型菌种,但仍具有变态反应原性;用死菌液10亿/0.1ml给致敏动物作皮试,亦出现良好的变态反应。24小时反应强度为15.8—18.4mm;48小时为6.8—10.8mm。犬种菌液热处理后,其上清液经硫酸铵透析,取其粗提蛋白作为变态反应原,用50μg/0.1ml给致敏动物作皮试,经犬种菌免疫的动物出现弱变态反应(24小时均在10mm以下),经活菌苗致敏的动物出现较强的变态反应(24小时为13—14mm,48小时为10.5—11mm)。犬种     

合成多肽对结核分枝杆菌的胞内抑制作用

评价合成多肽对人白血病单核巨噬细胞THP-1的毒性和对结核分枝杆菌H37Rv的胞内抑菌作用。通过多肽的不同给药浓度,确定多肽对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度(MIC),利用流式细胞术方法和MTT法检测2号肽对细胞THP-1的毒性作用,同时采用CFU方法检测其对H37Rv菌株的胞内抑菌作用。筛选的4条多肽均有抑菌作用,其中2号肽的最小抑菌浓度(MIC)最小,为200μg/m L。2号肽与细胞THP-1作用时,浓度为1 200μg/m L时表现出细胞毒性,与INH细胞毒性无显著差别。对于胞内H37Rv,2号肽抗结核作用具有时间和剂量依赖效应,随给药时间和剂量的增加H37Rv菌落数明显下降。2号肽不仅对巨噬细胞THP-1的毒性小,而且具有较好的抗胞内结核分枝杆菌活性,是一种潜在的抗结核新型药物。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的:克隆结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,经序列测定正确后进行融合表达和纯化。方法:采用PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009结构域基因,用限制性内切酶消化后插入pUC-19克隆载体中,经测序正确后亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了N端带6个连续组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果:获得了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,得到融合6个组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,纯化获得的蛋白纯度大于87%。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为后续深入研究奠定了基础。     

3种中药对分枝杆菌抗菌作用的研究

本文介绍野菊花、鱼腥草及鬼针草对强毒人型结核分枝杆菌(H_(37)Rv)、堪萨斯分枝杆菌和胞内分枝杆菌的抗菌作用。结果表明,对H_(37)Rv野菊花水煎剂的最低抑菌浓度为2.5mg/ml,鱼腥草水煎剂为10mg/ml,鬼针草水煎剂未见明显作用;对堪萨斯分枝杆菌野菊花和鱼腥草水煎剂的最低抑菌浓度均为10mg/ml,鬼针草水煎剂为5mg/ml;对胞内分枝杆菌3种中药水煎剂均未显示出抗菌作用。选用有抗菌作用的中药,以超薄切片技术,电镜观察细胞超微结构变化特点。野菊花作用后的H_(37)Rv主要是细胞壁发生改变,     

耐药结核分枝杆菌基因组信息挖掘

<正>由于结核分枝杆菌的耐药性问题,使结核病这个古老的传染病死灰复燃,并成为全球性的严重公关问题。从1998年首个结核分枝杆菌(H37Rv)全基因组完成图的获得[1],到近年来采用新一代测序技术对多个菌株进行高通量的基因组测序与分析,对结核分枝杆菌进化及耐药机制的认识不断深入。关于结核分枝杆菌菌株的基因组比较分析有多篇报道,包括对中国12个省来源的161株结核分枝杆菌     

分枝杆菌脂聚糖的分离、纯化及其结构和功能分析

【目的】建立分离、纯化分枝杆菌脂聚糖的方法,初步比较分析不同菌株来源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)和脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)的结构差异及研究脂聚糖刺激对巨噬细胞环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达的影响。【方法】应用Triton X-114液相法提取脂聚糖,电洗脱法分离纯化,基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)进行分子量鉴定;基于特异性识别非还原性末端α-D-甘露糖基的刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)分析新诺分枝杆菌JDM601、结核分枝杆菌H37Rv标准株和耻垢分枝杆菌mc2155脂聚糖的结构差异;进一步用Western blot检测脂聚糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结果】通过电洗脱法成功纯化出3种菌株脂聚糖;MALDI-TOF/TOF-MS鉴定发现,分子量从小到大依次为新诺分枝杆菌JDM601、耻垢分枝杆菌mc2155和结核分枝杆菌H37Rv来源的脂聚糖。Western blot显示,Con A能与结核分枝杆菌H37Rv标准株来源的LAM相互作用,而不能与新诺分枝杆菌JDM601和耻垢分枝杆菌来源的LAM相互作用;并且发现Con A与新诺分枝杆菌JDM601来源的LM有很强的反应,然而与其余两种来源的LM反应很弱。3种菌株来源的脂聚糖均能刺激RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结论】首次成功对来源于中国临床分枝杆菌分离株的脂聚糖进行了分离纯化,初步探讨了不同菌株来源分枝杆菌脂聚糖的结构差异,并表明LAM和LM均能刺激巨噬细胞诱导COX-2蛋白的表达,为进一步研究其对宿主的毒力和免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv刺激巨噬细胞后差异表达lncRNA分析及鉴定

分析毒性结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)H37Rv刺激RAW264.7巨噬细胞的表达谱芯片以及筛选和鉴定M.tb H37Rv感染巨噬细胞RAW264.7后差异表达的lncRNA。首先,分析热灭活的H37Rv刺激RAW264.7细胞24h后lncRNA表达谱芯片,并对差异表达的lncRNA和mRNA进行生物信息分析,然后采用实时定量聚合酶链反应对16条在芯片中差异表达的lncRNA进行细胞水平验证;进一步在H37Rv感染小鼠的脾脏和肺脏中检测差异表达的lncRNA。结果显示,表达谱芯片中4 730条lncRNA的表达水平上调,9 558条lncRNA的表达水平下调。生物信息分析筛选的16条lncRNA,其染色体定位于附近蛋白质编码基因的基因间区或者与外显子区域有重叠,mRNA功能注释显示差异表达的mRNA主要集中于转录调节、磷酸化、凋亡等生化过程以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等抗结核的信号通路中。在H37Rv作用下的细胞水平和动物感染模型的组织中RT-q PCR验证出与芯片结果相同的4条lncRNA,其中上调的有3条,下调的有1条。研究中异常表达的lncRNA可为巨噬细胞在结核分枝杆菌感染中的功能紊乱提供线索,为后续的研究奠定基础,进一步的研究将集中于发掘lncRNA在宿主调控中发挥的功能。     

结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统 maz EF6缺失突变株的构建及其表型的初步探讨

为构建结核分枝杆菌毒素‐抗毒素系统 m azEF6缺失突变株,并对其表型进行初步探讨,首先用聚合酶链反应（PCR）分别从H37Rv标准株和PUC‐19K质粒扩增出 mazEF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan ;然后应用融合PCR技术将 mazEF6基因的同源臂与 kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,将该融合片段克隆于pMD‐19T（simple）载体形成自杀质粒pMD‐19T‐ΔmazEF6‐kan ,并将自杀质粒转化至大肠埃希菌DH5α中;最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中,在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上筛选H37Rv ΔmazEF6缺失突变株单个菌落,提取阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段并测序。将所获得的H37Rv ΔmazEF6缺失突变株进行遗传稳定性检测后,对其表型进行初步研究。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变;与野生株相比,缺失株生长速度缓慢且细菌形态短小。本研究证实,融合PCR技术便于快速获得结核分枝杆菌缺失突变株;结核分枝杆菌在缺失毒素‐抗毒素系统 m azEF6基因后生存能力下降,这为进一步研究毒素‐抗毒素系统的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。