嗜水气单胞菌中类组蛋白HupB生理功能的研究北大核心

【目的】DNA结合蛋白HU蛋白是一类组蛋白样蛋白,其参与细菌DNA的重组与修复,在细菌的转录调控中发挥重要作用,但目前该蛋白对细菌生理功能的影响尚不完全清楚。为了更好地理解HU蛋白,本研究探讨HupB的生理功能。【方法】以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ATCC7966为研究材料,利用同源重组技术构建编码HU蛋白β亚基的hupB基因缺失菌株,并对其常见生理表型进行测定。【结果】hupB基因缺失菌株的溶血性、胞外蛋白酶活性和运动性均显著增强,而生物被膜形成能力显著下降,并且ΔhupB::hupB菌株中生物被膜形成能力恢复。进一步利用基于label-free的定量蛋白质组学技术比较了野生株和ΔhupB突变株的差异表达蛋白,发现235个蛋白表达上升,224个蛋白表达下降。生物信息学分析显示hupB敲除后导致蛋白质翻译、生物被膜生成以及信号转导等多个生物过程相关蛋白表达发生变化。【结论】研究结果表明嗜水气单胞菌HupB蛋白能显著影响细菌生物被膜形成能力,以上研究为更好地探究嗜水气单胞菌HupB蛋白对细菌生理功能的调控机制提供理论基础。     

嗜水气单胞菌zntR调控的生理功能及其机制研究

【目的】ZntR是一种金属调控蛋白,可催化锌外排基因的转录激活,防止细胞内二价Zn离子过量,但其对细菌生理功能的影响目前尚不清楚。【方法】本研究构建了嗜水气单胞菌ATCC7966(Aeromonas hydrophila,A.h)的zntR缺失株及补救株,对菌株的生物被膜形成能力、溶血活性、运动能力和响应金属离子胁迫等生理表型进行评估。【结果】敲除zntR基因的菌株对锌和铬离子胁迫敏感、对钴离子胁迫耐受,并且生物被膜形成能力下降、运动能力增强,这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。进一步利用DIA定量蛋白质组学技术比较野生株和zntR缺失株的蛋白表达差异,发现ZntR还可能参与双组分系统、细菌的趋化性等代谢通路的调控。【结论】该研究结果可为今后深入探讨zntR转录因子参与细菌生理功能的调控机制提供理论依据。     

嗜水气单胞菌ntrC调控的生理功能及其机制研究

[目的] NtrC是一种与DNA结合的转录调控因子,在激活氮同化基因的转录和维持氮源供应中具有重要作用,本研究拟探究其对嗜水气单胞菌生理功能的影响及其作用机理。[方法] 本研究采用同源重组方法构建了嗜水气单胞菌ATCC 7966 ntrC的缺失株,并以野生株为对照,对缺失株的生理表型进行测定和分析,利用定量蛋白质组学技术比较野生株和ntrC缺失株的蛋白表达差异。[结果] 发现敲除ntrC基因后,嗜水气单胞菌在缺氮、渗透压、重金属离子、氧化以及不同抗生素胁迫下的耐受性都发生显著变化,且这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。定量蛋白质组学分析发现,野生株和ntrC缺失株的差异表达蛋白可能参与氨基酸生物合成、抗坏血酸和醛糖酸盐等代谢通路的调控。[结论] 本研究阐明了ntrC在嗜水气单胞菌中的重要作用及其对细菌生物学功能的影响,探讨了ntrC直接或间接调控的蛋白与生理表型之间的联系,研究结果可为未来水产致病菌的防治提供理论支持。     

AmoA、AmoE和AmoF蛋白在嗜水气单胞菌铁载体合成中的作用研究

铁载体被认为是嗜水气单胞菌的毒力因子之一, 其由amoCEBFAGH七个基因编码, AmoCGH在前人的研究中已证实参与铁载体的合成。RT-PCR实验表明amoAEF基因的表达受到铁的调控。为进一步探究amoAEF基因的功能, 利用融合PCR和基因同源重组原理, 以自杀性质粒PRE112为载体构建基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF。通过CAS平板检测实验以及arnow实验来检测野生株WT与各基因缺失突变株铁载体的合成情况, 并比较野生株与各缺失株在低铁培养基中的生长差异。结果显示, 成功构建了基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF; 在富铁条件下, 基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF的生长与野生株无显著性差异, 但在低铁条件下, 基因缺失株ΔamoA、ΔamoE和ΔamoF的生长能力、铁载体合成能力显著低于野生株。可见, amoA、amoE和amoF基因是嗜水气单胞菌铁载体合成的关键基因, 其缺失会导致细菌在低铁环境中的生长受到抑制。     

诸氏鲻虾虎鱼出血病病原鉴定及传播途径分析

目的分离鉴定诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)出血病病原,并探讨其传播途径,为虾虎鱼微生物质量控制提供技术依据。方法从患出血病虾虎鱼肝脏取样分离病原菌,经菌落形态、生化特性和分子特征鉴定细菌,回归感染确定其致病性,并采用双重PCR方法对虾虎鱼、轮虫、卤虫、水进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)检测。结果分离到1株优势菌PYMc15-1,该菌株API生化反应结果与嗜水气单胞菌一致,gry B序列与Gen Bank上的嗜水气单胞菌相应基因序列同源性最高;根据已知序列构建gry B分子系统进化树,分离株PYMc15-1与嗜水气单胞菌聚类;分离株PYMc15-1溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)检测结果阳性,对虾虎鱼半致死剂量(median lethal dose,LD_(50))为每尾1. 2×104cfu。野生虾虎鱼、卤虫和野生轮虫致病性嗜水气单胞菌检测出现阳性结果,虾虎鱼封闭群、室内培育的轮虫以及海水样品致病性嗜水气单胞菌检测均为阴性。结论嗜水气单胞菌可自然感染虾虎鱼;野生虾虎鱼和生物饵料是其潜在传播媒介,引进虾虎鱼和生物饵料时应检测该病原。     

2型猪链球菌SSU0448基因敲除突变株的构建及其毒力分析

【目的】 通过构建2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33的SSU0448基因缺失突变株Δ0448和互补株CΔ0448,探索SSU0448基因缺失对细菌基本生物学特性和细菌毒力的影响。【方法】用同源重组基因敲除方法构建筛选强毒株05ZYH33中N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢途径相关转录调节因子SSU0448基因的缺失突变株,比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、互补株CΔ0448的基本生物学特性,小鼠毒力实验分析SSU0448基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】PCR检测分析显示,SSU0448基因在转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明基因敲除突变株构建成功;同时构建了基因功能互补株CΔ0448。生物学特性实验表明突变株Δ0448在成链能力上较野生株明显减弱,对数生长期稍短,快速到达平台期;而菌落形态、革兰氏染色和溶血活性方面无明显差异;小鼠毒力实验发现,突变株毒力并无显著改变。【结论】SSU0448基因的敲除能够改变2型猪链球菌的成链能力;不影响其侵袭致病能力,可能延缓2型猪链球菌的发病过程,此研究为2型猪链球菌致病感染奠定了基础。     

无乳链球菌鱼源株10 kb基因序列对细菌致病力的影响

【目的】在前期比较基因组学分析中,我们发现中国无乳链球菌鱼源株GD201008-001基因组中有一段10 kb基因序列,内含11个未知功能的开放阅读框。为了研究该段基因序列与细菌的致病力的关系,本研究将这段基因进行了全段缺失。【方法】运用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒p SET4s,构建了10 kb基因缺失株(Δ10 kb),并通过生物学性状的比较,细胞粘附试验,斑马鱼攻毒试验和缺失前后毒力相关基因转录水平的检测,评价该序列对无乳链球菌毒力的影响。【结果】经测序证明缺失株Δ10 kb构建成功,与亲本株GD201008-001相比较,缺失株Δ10 kb在细菌染色形态、对HEp-2细胞的粘附能力无明显差异,但在培养液中的生长速度略慢;缺失株Δ10 kb对斑马鱼的毒力明显增强,LD_(50)有极其显著的差异(P0.001);编码菌毛骨架蛋白2b的基因(PI-2b)和唾液酸酶基因(neul)在缺失株中的转录水平明显上升。【结论】该序列对无乳链球菌GD201008-001的毒力有显著的影响,可能调控某些毒力基因的转录表达,使细菌的毒力减弱。     

斑马鱼嗜水气单胞菌的鉴定和人工感染组织病理学研究

从患病斑马鱼体内分离致病菌株并进行鉴定,观察人工感染分离菌株后组织病理学变化。通过对分离菌株ZF4形态特征、生理生化特性、保守基因和系统发育树建立等综合分析进行鉴定。结果显示,ZF4为β溶血的革兰氏阴性短杆菌,吲哚试验为阳性,发酵葡萄糖、蔗糖等糖类,AHA_0438、ASP、gyr B和16S r RNA等基因均为阳性,基于gyr B、16S r RNA基因系统发育分析结果显示ZF4为嗜水气单胞菌。人工感染后斑马鱼临床症状明显,发生肝脏组织变性、肠道内膜脱落、脾脏充血、胰腺间质纤维组织增生等组织病理学变化。斑马鱼体内分离的ZF4鉴定为致病性嗜水气单胞菌,且斑马鱼对该菌敏感,因此斑马鱼可作为研究嗜水气单胞菌的动物模型。     

嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶的表达、纯化及特性分析

摘要：【目的】表达、纯化嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的性质进行分析。【方法】以pET-32a为表达载体将弹性蛋白酶基因ahyB转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,表达重组酶用His TaqNi2+亲和层析柱纯化并用6 mol/L盐酸胍进行复性;利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析对嗜水气单胞菌培养上清液中的弹性蛋白酶进行纯化。将【结果】从嗜水气单胞菌培养上清液中获得的弹性蛋白酶原酶的最适pH 为8.5,而表达重组酶为 10.0;对热的稳定性,原酶高于表达酶。两种形式酶的性     

禽致病性大肠杆菌gspL基因缺失株构建及生物学特性

【目的】研究gsp L基因缺失对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响。【方法】利用Red重组方法构建禽致病性大肠杆菌DE17株的gsp L缺失株;分析野生株与缺失株的生长特性、黏附和入侵DF1细胞的差异;采用荧光定量PCR的方法比较野生株和缺失株毒力基因转录水平的变化;比较野生株与缺失株的半数致死量(LD50)差异。【结果】gsp L缺失不影响DE17的生长特性,但其黏附和入侵DF1细胞能力显著下调。荧光定量PCR检测结果表明,缺失株毒力基因lux S,pfs,fyu A和iss转录水平明显上调,tsh的转录水平明显下调,而vat,ibe A,stx2f和omp A的转录水平无显著变化;LD50检测结果表明,缺失株比野生株毒力增强了12倍。【结论】gsp L基因的缺失不影响禽致病性大肠杆菌的生长特性,但能减弱其黏附和入侵能力,且可以正调控禽致病性大肠杆菌部分毒力基因的转录水平,推测gsp L基因可能与APEC对宿主的致病性有关。     

茎瘤固氮根瘤菌环二鸟苷酸代谢相关基因的功能鉴定

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571中c-di-GMP合成酶AZC-2412的编码基因缺失的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】本实验构建基于cre-loxp重组酶系统的根瘤菌基因敲除系统,以及采用三亲接合技术构建突变株。测定野生型和突变株的生长速率、趋化能力、胞外多糖产量、生物膜形成等表型。【结果】突变株与野生型生长速率几乎相同。与野生型相比突变株由于细胞内c-di-GMP水平降低,胞外多糖、生物膜产量等均有所下降。【结论】实验表明,环二鸟苷酸合成酶AZC-2412缺失,使得c-di-GMP水平降低,对胞外多糖生成、细菌的运动能力、生物膜的形成、细胞絮凝、与植物的互作等均有调控作用。     

一株分离自流浪猫的猪链球菌9型的分子生物学鉴定北大核心CSCD

【目的】猪链球菌是一种能感染人和猪的人畜共患病病原,并且还可零星感染多种哺乳动物。本试验旨在调查流浪猫携带猪链球菌的情况。【方法】在流浪猫身上分离猪链球菌,经血清凝集实验和PCR检测,鉴定其血清型;经多序列位点分型分析,鉴定其ST型;将所分离的细菌与Gen Bank上已公布的猪链球菌构建16S rRNA的系统发育树,分析该菌株与其他猪链球菌的亲缘关系;药敏纸片法分析其耐药性;小鼠攻毒试验分析其毒力。【结果】本试验在流浪猫身上分离到一株猪链球菌,命名为m70,其血清型为9型。多序列位点分型显示,m70株属于一个新的ST型。与Gen Bank上已公布的猪链球菌16S rRNA进行系统发育树分析,结果显示m70属于一个单独的分支。m70与临床菌株的耐药情况相似,对四环素耐药,对红霉素中介耐药,对氨苄西林敏感。小鼠攻毒试验显示,感染10~8 CFU剂量m70的小鼠,死亡率达到60%–80%（3/5–4/5）,3次攻毒试验的平均LD（50）为5.1×107 CFU;而本实验室保存的猪链球菌强毒株HA9801感染小鼠的平均LD（50）为3.9×107 CFU,两者之间没有显著差异（P〈0.05）。【结论】从流浪猫身上分离得到的猪链球菌m70属于优势血清型,且毒力较强,提示一些流行血清型的猪链球菌强毒株具有从流浪猫传染人的潜在风险。     

丙酮丁醇梭菌硫氧还蛋白系统在溶剂生产过程中的功能

【目的】探究丙酮丁醇梭菌硫氧还蛋白系统在生长和代谢过程中的功能。【方法】使用ClosTron系统对硫氧还蛋白系统中的硫氧还蛋白还原酶基因(trxB)进行插入失活,得到突变株,通过Southern杂交方法验证插入内含子的拷贝数;在基本培养基中进行分批发酵,比较并分析突变株的生长特点;通过pH控制,利用限磷的连续发酵方法使丙酮丁醇梭菌稳定地在产酸期和产溶剂期生长,分析野生型菌株和突变株在稳定的产酸期和产醇期的生长和产物合成情况;通过添加不同浓度的过氧化氢检测野生型和突变株的抗氧化压力。【结果】抗性筛选和基因测序结果表明,成功构建了硫氧还蛋白还原酶失活的突变株,命名为Clostridiumacetobutylicum trxB::int(29)。在分批发酵中,突变株和野生型菌株的最大生长量相近,细胞在600 nm处的光吸收值(OD600)达到6.5,但是突变株在36 h的OD600达到最大,较野生型推迟12 h;在连续发酵的产酸期,野生型菌株与突变株生长变化不大,OD600分别稳定在4.6和4.4,且葡萄糖的消耗和酸产量相差不大;在产溶剂期,突变株的OD600稳定在3.5,低于野生型的4.0...     

甲基营养菌MB200中mutS的缺失及高浓度甲醇和甲醛诱变

【背景】甲基营养菌(Methylobacterium)是一类能够以单碳或非C-C键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛等)为底物生长,并可生产多种代谢产物如氨基酸、工业酶和辅助因子、多羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)、多糖和类胡萝卜素等的革兰氏阴性细菌。【目的】通过突变甲基营养菌MB200的mutS基因,在胁迫条件下定向诱导,以获得可以耐受高浓度甲醇和甲醛的生产菌株。【方法】利用三亲本结合构建mutS基因缺失的高突变菌株MB200sTB,逐步提升培养液中甲醇、甲醛的浓度进行定向诱导突变,对获得的高耐受性突变株进行回补,分析菌株的生长情况。【结果】构建了mutS基因的缺失突变体MB200sTB,并且得到了高耐受甲醇和甲醛的菌株MB200sHBc和MB200sHBq。MB200sHBc与野生株MB200相比其甲醇耐受性得到了极显著的提高,甲醇耐受浓度从8g/L提升到44g/L,但生长量不受影响。MB200sHBq在以甲醛为0.45g/L的碳源条件下,生长量相较于野生型MB200提高了1.69倍。【结论】通过定向诱导缺失mutS基因的突变体,可获得具有生产应用潜力的...     

苏云金芽胞杆菌Sigma54和CcpA共同调控的基因鉴定

【目的】通过综合分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD73菌株Sigma54缺失突变体的转录组数据和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579菌株CcpA缺失突变体的转录组数据,并进行启动子与CcpA蛋白的体外结合验证,明确Bt HD73菌株中Sigma54和CcpA共同调控的基因,丰富了对微生物的代谢调控网络的认识。【方法】以转录组测序结果为基础,通过基因同源性的比对在Bt HD73菌株中寻找受Sigma54和CcpA共同调控的基因,在这些基因中找到具有cre序列的启动子,通过凝胶阻滞验证这些启动子与CcpA蛋白的结合。【结果】Bt HD73菌株中有31个基因受Sigma54和CcpA共同调控,其中14个基因的启动子序列包含cre序列,这些启动子都可以与CcpA蛋白发生体外结合。【结论】Bt HD73菌株中有14个基因直接受CcpA的调控,同时其转录受Sigma54的控制。     

沙门菌噬菌体抗性菌的筛选鉴定及致病力研究

【目的】筛选鉴定沙门菌噬菌体侵染裂解过程中的抗性菌株,研究抗性菌株的生物学特性及致病力的差异,为解决噬菌体治疗应用中的抗性菌问题提供理论依据。【方法】本研究通过次级感染法和双层平板法筛选沙门菌噬菌体抗性菌,通过生物学特性和毒力基因检测比较宿主菌ATCC 13076及其噬菌体抗性菌株R3之间的差异,并通过小鼠攻毒实验和细胞粘附实验比较致病力强弱。【结果】噬菌体抗性菌株R3的生长速度较宿主菌略慢;生化及毒力基因检测均表明抗性菌株与宿主菌无差异;与宿主菌相比,抗性菌R3的LD50增加了74.8%(P0.05);对MODE-K细胞粘附能力稍弱,但是差异不显著。【结论】该研究表明,与噬菌体宿主菌相比,噬菌体抗性菌株的生物学特性和毒力基因并没有改变,对小鼠致病力减弱,但是对MODE-K细胞粘附能力差异不显著。     

连翘提取物对嗜水气单胞菌群体感应系统的影响

【背景】传统抑菌剂的大量使用导致细菌产生多重耐药性与抗性,而基于细菌群体感应靶点调控的新型抑菌剂可缓解细菌耐药性与抗性,是未来抑菌剂的发展方向之一。【目的】研究连翘(Forsythiasuspensa)提取物对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)群体感应系统的影响及可能的作用机制,为新型抑菌剂的开发提供理论依据。【方法】以紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026为报告菌株,以嗜水气单胞菌为供试菌株,采用倍比稀释法测定连翘提取物对2种菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),通过微量法测定提取物对嗜水气单胞菌生长、群集运动及蛋白酶活性的影响,利用高效液相色谱串联质谱法分析提取物中的主要成分,采用分子对接模拟探究提取物对嗜水气单胞菌群体感应系统的作用机制。【结果】连翘提取物对紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的MIC均为16.00mg/mL。在亚抑菌浓度下,连翘提取物处理显著抑制了CV026紫色菌素的产生,最大抑制率高达56.30%。经8.00mg/mL连翘提取物处理后,嗜水气单胞菌的群集运...     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。