丙酮丁醇梭菌硫氧还蛋白系统在溶剂生产过程中的功能

【目的】探究丙酮丁醇梭菌硫氧还蛋白系统在生长和代谢过程中的功能。【方法】使用ClosTron系统对硫氧还蛋白系统中的硫氧还蛋白还原酶基因(trxB)进行插入失活,得到突变株,通过Southern杂交方法验证插入内含子的拷贝数;在基本培养基中进行分批发酵,比较并分析突变株的生长特点;通过pH控制,利用限磷的连续发酵方法使丙酮丁醇梭菌稳定地在产酸期和产溶剂期生长,分析野生型菌株和突变株在稳定的产酸期和产醇期的生长和产物合成情况;通过添加不同浓度的过氧化氢检测野生型和突变株的抗氧化压力。【结果】抗性筛选和基因测序结果表明,成功构建了硫氧还蛋白还原酶失活的突变株,命名为Clostridiumacetobutylicum trxB::int(29)。在分批发酵中,突变株和野生型菌株的最大生长量相近,细胞在600 nm处的光吸收值(OD600)达到6.5,但是突变株在36 h的OD600达到最大,较野生型推迟12 h;在连续发酵的产酸期,野生型菌株与突变株生长变化不大,OD600分别稳定在4.6和4.4,且葡萄糖的消耗和酸产量相差不大;在产溶剂期,突变株的OD600稳定在3.5,低于野生型的4.0...     

丙酮丁醇梭菌半胱氨酸合成途径中铁氧还蛋白和胱硫醚-γ-裂解酶基因功能

【目的】探究丙酮丁醇梭菌半胱氨酸合成代谢途径上铁氧还蛋白和胱硫醚-γ-裂解酶基因的功能。【方法】使用ClosTron系统对半胱氨酸合成途径上的铁氧还蛋白基因(fer)和胱硫醚-γ-裂解酶基因(mccB)进行失活,得到突变株;在不同硫源的培养基中进行分批发酵,分析突变株的生长特点;通过pH控制,使用限磷的连续发酵方法将丙酮丁醇梭菌维持在产酸期和产溶剂期,分析野生型菌株和突变株在连续发酵中的生长情况。【结果】成功构建Δfer和ΔmccB突变株。在分批发酵中,敲除fer基因的突变株无法利用硫酸盐作为硫源,但添加亚硫酸盐或半胱氨酸可以使其恢复生长;在以半胱氨酸为唯一硫源进行分批发酵时,其终浓度1 mmol/L时不会影响野生型与Δfer突变株的生长,但高于1 mmol/L时生长均会受到抑制。在连续发酵中,Δfer突变株不能在产溶剂阶段生长,添加过量的半胱氨酸也不能恢复生长;敲除mccB基因的突变株仍能在添加甲硫氨酸的培养基中生长,但最大OD仅为野生型的57%;相较于野生型,ΔmccB突变株在产酸期和产溶剂期的生长均受到抑制。【结论】fer基因为半胱氨酸合成途径中硫酸盐还原为亚硫酸盐的关键基因,其控制合成的半胱氨酸不能完全由外源的半胱氨酸替代,敲除后对生长的抑制主要表现在连续发酵中的产溶剂阶段。mccB基因参与调控甲硫氨酸转化为半胱氨酸的过程,其敲除会影响甲硫氨酸到半胱氨酸的转化,但不会阻断该生物反应过程。     

斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

[目的]研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异.[方法]用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长.[结果]cbh1基因全长为1500 bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602).克隆并分析了1.9 kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CRE Ⅰ与纤维素酶转录调控蛋白ACE Ⅰ的两个的潜在结合位点.[结论]在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2.两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的.