PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立

对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为：液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph（含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph）转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。     

农杆菌介导香菇菌丝遗传转化体系的研究

香菇Lentinula edodes是世界第二大食药用真菌,随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,建立稳定的香菇转化体系是目前的研究热点。本文将探索以农杆菌为介导的遗传转化体系在香菇中进行随机插入突变的转化效率以及稳定性。构建的质粒p YN6982以潮霉素抗性基因hyg作为筛选标记基因,以增强型荧光蛋白基因egfp作为报告基因,以农杆菌EHA105和LBA4404为介导,同时转化了孢子单核体、原生质体单核体和双核体菌株。结果表明采用小米粒培养基进行菌丝培养和转化,经潮霉素抗性筛选,以及5代传代后,对转化子中的hyg和egfp基因进行PCR扩增和测序,验证了转化子的遗传稳定性。经过荧光显微观察表明,EGFP在转化子中可稳定表达。本研究探索出一种采用小米粒培养基培养菌丝并进行转化的新方法,建立了稳定的农杆菌介导的香菇遗传转化体系,为进一步开展香菇的基因功能研究奠定了良好的基础。     

PEG介导的黑附球菌遗传转化体系的建立

以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因（ hph）为筛选标记,应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究。潮霉素敏感性测试结果表明,黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/L。PEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为：30℃下用2%裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h,过滤收集原生质体,经MTC清洗重悬后将质粒pYF11-hph转化黑附球菌原生质体,在RM培养基中混匀再生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证,表明外源基因 hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达。本实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系,为研究其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障。     

黄孢原毛平革菌基因启动子的分离与鉴定

利用启动子探针型载体pSUPV8直接在大肠杆菌(Escherichia coli)中分离黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子片段,获得6个潮霉素抗性(Hyg-r)重组子。对重组子CH2、CH6进行序列分析,结果发现它们都存在真核生物基因启动子的保守序列;用原生质体转化法将其转化黄孢原毛平革菌,仅pCH6获得了潮霉素抗性转化子;PCR和斑点杂交分析表明,pCH6已成功导入黄孢原毛平革菌,并启动潮霉素抗性基因的表达。     

通过PEG法转化甘蓝获得转基因植株

通过PEG法将外源基因导入甘蓝(Brassica oleracea L.)下胚轴原生质体。以潮霉素和卡那霉素进行筛选,均成功地得到了抗性愈伤组织。对于潮霉素抗性愈伤组织,其绝对和相对转化频率分别为4.1×10~(-4)和1％～3％,在分化培养基上,抗性愈伤组织能够分化出芽。诱导生根后进行移栽,生长状况良好。Southem blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。对影响转化的一些因素进行了探讨。     

PEG法介导蛹虫草遗传转化体系的建立

由于真菌的遗传转化体系中一般以原生质体作为受体细胞,因而对蛹虫草原生质体制备的各种因素进行比较研究。结果表明,蛹虫草原生质体制备的最佳体系为:液体培养4天的蛹虫草菌球,以0.8 mol/L甘露醇作为稳渗剂,加入含1.5%蜗牛酶+1.5%溶壁酶复合酶,在34℃酶解蛹虫草菌球4 h时,原生质体得率达到1.0×10~7个/ml。潮霉素筛选压实验表明,蛹虫草原生质体在PDA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为650 mg/L。采用正交试验的方法,设计PEG介导蛹虫草原生质体转化,将质粒p SB130-GFP转化蛹虫草原生质体,在荧光倒置显微镜下观察比较,得到最佳的转化体系为:PEG浓度为25%,冰浴时间为10 min,室温时间为20 min,质粒质量为30μg,原生质体个数为10~7个/ml。最终得到PEG法介导蛹虫草遗传转化的转化频率约为100~200个/μg(抗性转化子/质粒+10~7个原生质体)。转化子在含潮霉素的培养基上经4代以上的继代培养后仍可以表达潮霉素抗性并稳定遗传。为通过基因工程手段定向、快速改良蛹虫草药用品质,利用蛹虫草发酵方法生产一些具有重大经济价值的外源蛋白等奠定基础,并且有助于进一步了解蛹虫草这一大型真菌中基因的表达调控机制。     

红曲菌9903A转化体系影响因素的研究

采用PEG介导的原生质体转化方法,研究了将含有潮霉素抗性基因的质粒pMP-Hygro转入红曲菌9903A的影响因素。实验结果表明,原生质体转化最佳条件为:1.0mol/L的山梨醇为渗透压稳定剂;以含有50mmol/L的Ca2 和最终质量分数为40%的PEG4000为转化介质;最佳原生质体浓度和载体DNA用量分别为1×108个/mL、1μg/100μL原生质体;原生质体再生培养基采用不含无机盐的培养基,再生方式采用原生质体液涂布单层再生培基平板法。得到的平均DNA转化率可达160个/μgDNA。本文所研究的PEG介导的原生质体转化方法可以较好的向红曲菌细胞导入外源DNA,并使外源DNA在红曲菌细胞内大量表达。     

用灭活原生质体融合进行高温香菇育种I．融合产物的选出及其鉴定

用灭活的近裸香菇(Lentinus subnudus Berk.)双核菌株原生质体与香菇[L. edodes(Berk) Sing.] 双核菌株原生质体融合,在35℃的条件下选得融合子。融合频率为0—4.3x10^{-5。融合子与双亲有明显的拮抗性。融合子的菌丝形态、氨基酸含量,子实体的形态,以及酸性磷酸酶同功酶的测定都与双亲不同。}     

PEG介导的柱状田头菇遗传转化体系建立

柱状田头菇（茶树菇）Agrocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有极高的经济价值。随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。本研究以柱状田头菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因,应用PEG介导法进行柱状田头菇遗传转化体系研究。结果表明,150μg/mL潮霉素可以完全抑制柱状田头菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3h,能够获得最大得率的原生质体。通过PEG介导将构建好的DNA片段转化入柱状田头菇原生质体,通过潮霉素抗性筛选获得转化子,转化得率达到7个/μg DNA。PCR验证和荧光显微镜观察,外源片段成功转入柱状田头菇中并稳定表达。本研究建立的PEG介导转化体系,为柱状田头菇基因功能研究提供了技术基础。     

香菇原生质体分离诱变育种研究

通过ＵＶ处理香菇原生质体后得到的１０５株再生菌株与它们亲本菌株的菌丝生长速度,产量和出菇期进行了比较。约有３０％的再生菌株获得了较高的产量和较早出菇期的优良特性、多次继代培养证明,这些再生菌株获得的优良特性稳定。研究结果表明,香菇原生质体分离诱变是一种很有应用价值的食用菌菌种选育方法。     

用ITS和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种

通过选用香菇生产中存在名称争议或者名称相近或者同一名称但长期在不同地区栽培的12株香菇生产菌株,以及用于种水平对比的豹皮香菇Lentinuslepideus和虎皮香菇Lentinustigrinus的4个菌株,共16个菌株作为供试材料,进行ITS和ISSR遗传分析,并用RAPD技术验证试验结果。结果证明,不同种的ITS长度存在差异,再次证明ITS可以有效区别种之间的菌株;在ISSR的菌株水平分析中,香菇种内材料拥有两个共同的条带,与其他两种菌株的带型图谱有着明显差异,其中5对材料的带型图谱极为相近。RAPD验证结果与上述结果相近。由此可见,结合ITS与ISSR技术是可以用作香菇生产菌株鉴别的,这为ITS和ISSR分子标记技术推广应用于香菇生产菌株的快速准确鉴别提供了技术依据。     

中国香菇自然群体的交配型因子分析*

以自收集于中国14个省、区的53个野生香菇菌株分离得到的94个单核体为材料,进行了交配型因子分析。从该样本中鉴定出66个不同的A因子和72个不同的B因子,而且A、B不亲和性因子系列中的特异性因子均呈等概率分布。据此估算在中国香菇自然群体中存在121个特异的A因子和151个特异的B因子,表明中国香菇自然种质中蕴藏着丰富的遗传多样性。     

SCAR分子标记技术在香菇菌株鉴定上的应用研究

为了建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定香菇菌株的有效方法,本研究首先通过对生产上常用的14个香菇菌株进行RAPD多态性分析,从香菇菌株162中扩增获得了一个片段长为1166bp的特异RAPD标记XG1166,随之利用分子克隆技术将该特异RAPD标记成功转化为稳定的SCAR标记。用同样的方法,本研究又从另一香菇菌株申香10号中获得了一段长度为347bp的特异SCAR标记SX347。试验结果表明,利用本研究获得的香菇菌株162和申香10号的特异SCAR标记,能在一天时间内准确鉴定出香菇菌株162或申香10号菌株的真伪。由此可见,SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定香菇菌株的新方法, 可应用于食用菌种质资源保护利用、品种分类与鉴定和假种辨别。     

香菇新菌株选育

采用香菇135双核体秋水仙碱(C22H25NO6)诱变及香菇K303单核体秋水仙碱诱变的菌株388B1与香菇JL-2双核体杂交(单×双)的方法,成功地获得了优良的诱变菌株(编号为K05)和杂交菌株(编号为K48)。经拮抗试验、酯酶同工酶、分子标记等多种方法鉴定和栽培试验证明,诱变、杂交菌株为有别于出发菌株和亲本菌株的新菌株;3年的栽培比较试验结果表明:新菌株比当地主栽香菇135、939高产,K05比135每筒平均增产28.5%,K48比939每筒平均增产10.7%,产量生物学统计显示增产显著;经济性状考评为优质,菌柄短、菇形圆整。该研究成果不仅有望满足菇农对香菇新菌株的需求,而且可为香菇育种提供新的途径。     

Relationships between ligninolytic activities of Lentinula spp. and biotransformation of pentachlorophenol in sterile soil

Ligninolytic activities in strains of Lentinula edodes were related to pentachlorophenol biotransformation in sterile soil and activities in L. lepideus. Strains of L. edodes secreting laccase and manganese peroxidase activities also metabolized pentachlorophenol (PCP) significantly ( P < 0.05). Strains of L. lepideus showed neither enzymic activities nor xenobiotic breakdown. Lentinula edodes strains inhibited by PCP at 5 mg 1^-1 in agar, tolerated 200 mg kg^-1 in soil. Strain LE2 metabolized more PCP in nitrogen-sufficient than nitrogen-limited culture: the reverse was observed with Phanerochaete chrysosporium BKM 1767. Relationships between ligninolytic activities and pentachlorophenol breakdown in L. edodes indicated a suitability for soil bioremediation treatments.     

香菇中镉含量的检测与分析

为了解影响香菇镉富集的一些因素,对不同品种、不同地区、不同潮次的香菇以及香菇不同形态部分中的镉含量进行了比较研究。结果表明：不同品种香菇、不同地区以及不同潮次香菇中的镉含量具有一定的差异;此外,香菇的不同形态部分中镉的含量也不一样,其镉含量从高到低的顺序为：菌褶＞菌盖＞菌柄。     

香菇自然群体中个体间的空间分布及其遗传联系*

应用体细胞不亲和性反应、交配型因子分析和基因组ＤＮＡ的ＲＡＰＤ分析,研究了一个分布于方圆约１ｋｍ的６根倒木上的１８个香菇野生菌株间的遗传差异。结果表明,该群体大多数菌株间配对（８０．４％）体细胞不亲和,而同一倒木菌株间配对的体细胞亲和率达 ６２．５％。不同倒木菌株间未发现体细胞亲和的配对。该群体存在 １１个特异的Ａ因子和７个特异的Ｂ因子。同一倒木的菌株有的交配型因子相同,有的则不同。不同倒木的菌株大多数交配型因子不同,未发现交配型因子完全相同的菌株。ＲＡＰＤ分析显示,体细胞亲和的菌株,交配型因子完全相同的菌株,在基于ＤＮＡ相似系数的遗传相关聚类中,首先聚为小类。总起来看,在自然群体中,香菇个体间的遗传差异与其空间分布之间存在一定的联系,随着空间距离的增大,菌株间的异质性相应增高。     

香菇B交配型位点的分子遗传学结构研究II.一个香菇单核体的B位点结构的分子解析

在先前的工作中,曾经运用简并PCR和染色体步行的方法从香菇中获得了1个信息素受体编码基因和1个信息素前体编码基因。根据香菇135菌株的原生质体单核体的全基因组测序信息,设计了4对引物,用于扩增香菇苏香菌株的原生质体单核体SUP2中的信息素受体编码基因STE-3的同源物及其侧翼保守基因。实验结果共获得了33,655bp的DNA序列,运用BlastX搜索对所获得的序列进行同源性分析后,发现了7个推定基因,其中有3个为信息素受体编码基因。再根据信息素前体所具有的保守基序特征,在2个信息素受体编码基因附近发现了4个信息素前体编码基因。首次对香菇的B交配型位点的分子遗传学结构有了比较全面的了解。     

Selection of strains of Lentinula edodes and Lentinula boryana adapted for efficient mycelial growth on wheat straw

Mycelial growth rates are presented for 11 strains of Lentinula edodes and six strains of Lentinula boryana cultivated on solid media: derived from malt extract (MEA); malt yeast extract (YMEA); and, YMEA plus soluble lignin derivatives (YMEA+WSLD). The results were compared with data for mycelial growth rates, of the same strains cultivated on substrates derived from wheat straw treated at different temperatures (50, 65, 75 and autoclaving at 121 degrees C). In general, the addition of WSLD significantly reduced mycelial growth rates in both species. The greatest mycelial growth rate was obtained on sterilized straw at 121 degrees C for the majority of strains. However, this growth was not significantly different from that obtained at 75 degrees C. L. edodes showed greater growth rates than L. boryana. The feasibility of using estimates of mycelial growth rate on YMEA and YMEA+WSLD are discussed as possible indicators of a strain's potential for mycelial growth on substrates derived from wheat straw.     

担孢子介导传播对香菇双分体病毒LePV1群体形成的影响

【背景】LePV1为中国香菇种质资源中携带的主要病毒之一。在前期研究中,根据分子序列特征将LePV1带毒菌株群体分为两个分子类群(亚型I和亚型II),亚型I包含大部分带毒香菇菌株,而亚型II仅包含少数几个供试带毒香菇菌株,在地理上相距遥远的不同遗传背景香菇菌株中发现了同一LePV1分子类型。【目的】探究担孢子介导传播对香菇双分体病毒LePV1群体形成的影响。【方法】比较不同亚型菌株的有性担孢子后代带毒率差异,并采用单单杂交和单双杂交方式分析杂交对LePV1群体形成的影响等。【结果】亚型I中栽培菌株ZP51和野生菌株YS94的担孢子带毒率分别为70%和100%,亚型II中栽培菌株ZP28和野生菌株YS5的担孢子带毒率分别为45%和55%,暗示亚型I菌株担孢子传毒效率高于亚型II;当杂交配对的任一亲本携带LePV1时,无论是单单杂交还是单双杂交,获得的杂交子带毒率为100%。【结论】不同亚型担孢子病毒携带率的不同和杂交在香菇双分体病毒LePV1群体形成中可能发挥着重要作用;此外,LePV1不能在杂交不亲和的单核体之间传播,也不能在不亲和的单双杂交配对中进行传播;在杂交可亲和的单双杂交配对中,杂交成功的杂交子在与亲本双核体菌丝接触一段时间后,可以将病毒LePV1通过胞质传播传给亲本双核体菌丝体。该研究为明确香菇双分体病毒LePV1传播规律及LePV1群体形成机制提供了线索。