肾癌相关基因克隆——肾癌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建人肾癌与正常肾差异表达的cDNA消减文库.分别从肾癌及正常肾细胞系中提取poly(A)⁺RNA,依次合成单链及双链cDNA,经酶切成平均大小为400～600 bp的片段,将肾癌cDNA分为两组,分别与两种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增.构建成功具有高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,非特异性cDNA片段被有效地消减,特异表达的cDNA得到富集.文库扩增后得到6 500个克隆,随机挑取350个制备质粒,酶切分析均得到400～600 bp插入片段.所构建的人肾癌cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的未知新基因奠定了基础.     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

大鼠短间隔连续部分肝切除上调表达基因的克隆与分析 *

以短间隔连续部分肝切除112h为试验方,以0h对照为驱动方,应用抑制性消减杂交技术构建了高效率的正向消减cDNA文库,从中随机挑取的50个克隆中有45个包含了100～350bp插入片段,对这些片段进行测序后经GenBank blast同源性检索,表明8个片段均为未知新序列。大鼠短间隔连续部分肝切除后肝再生cDNA正向消减文库的建立和未知的上调表达基因片段的克隆为研究肝再生的分子机理奠定了基础。     

应用抑制消减杂交分离雌、雄鸡胚性分化早期的差异表达基因

分离不同性别的鸡胚性分化早期差异表达基因,可为禽类性别决定和性分化机制研究提供基本信息。本研究分别以孵化3.5-6d的雌、雄鸡胚性腺为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了雌-雄鸡胚间正、反向消减cDNA文库,并利用斑点印迹杂交从中筛选出了39个性别差异表达的阳性cDNA克隆。以持家基因GAPDH为参照指标检测消减文库的消减效率,结果发现两个文库的消减效率均高达25倍。插入片段PCR鉴定结果显示,消减文库中cDNA插入片段的长度主要分布于250-750bp之间。分别对雌、雄鸡胚消减文库中的252和168个cDNA克隆进行斑点杂交筛选,再随机从两个消减文库中共抽取39个阳性差异表达克隆进行序列测定及序列比对分析。结果表明:这39个cDNA克隆分别代表了定位于鸡不同染色体上的18个已知功能的基因和11个假定基因;参照哺乳动物同源基因的功能,所得的18个已知差异基因可能参与多种生物反应过程。用半定量RT-PCR方法对雌、雄鸡胚消减文库中各5个基因的表达情况进行进一步验证,发现除雌性库中的一个基因外其它9个基因均有较明显的性别差异表达。这些性别差异表达基因的获得为进一步研究鸡胚性腺发育中的基因表达调控奠定了基础     

抑制消减杂交和辐射小鼠血虚模型筛选"四物汤"诱导表达的基因

应用抑制性消减杂交技术构建受辐射小鼠血虚模型在中药四物汤诱导前后消减cDNA库,并从中克隆鉴定出与四物汤药效相关基因。从受辐射小鼠四物汤诱导前后骨髓细胞中提取mRNA并合成cDNA,分别作为tester和driver进行消减杂交及抑制性PCR,将PCR产物与载体连接构建cDNA库,高效电转化大肠杆菌进行库扩增,随机挑取其中的克隆进行酶切、测序分析。成功构建了具有高消减效率的受辐射小鼠四物汤诱导前后的消减cDNA库。库挑选得到512个阳性克隆。随机挑取30个插入片段测序,生物信息学分析结果显示大部分与红细胞分化、骨髓组织修复、结构重建有密切关系,其中8个为新基因片段。应用抑制性消减杂交技术所构建的受辐射小鼠四物汤诱导前后cDNA消减库为大批量筛选、克隆四物汤药效特异性相关基因奠定了基础。并从分子水平上发现四物汤对抑制凋亡、促进骨髓组织修复和结构重建、诱导红细胞分化的基因具有调节作用,可能和四物汤补血作用有关。     

快速老化模型小鼠海马正反向抑制消减cDNA文库的构建

目的:构建快速老化模型小鼠(SAM)海马正反向抑制消减cDNA文库,以揭示SAMP8学习记忆脑老化的机制,同时为研究阿尔茨海默病(AD)的发病机制提供线索。方法:以快速老化模型小鼠SAMP8和SAMR1海马的总RNA为材料,采用抑制消减杂交方法和蓝白斑筛选克隆构建文库,并用PCR鉴定了文库的质量。结果:成功构建了12月龄雄性SAMP8和SAMR1海马的正反向抑制消减cDNA文库,其中正向文库包含864个克隆,反向文库包含960个克隆,阳性克隆率为96.16%,插入片段范围为250～2000bp。结论:SAMP8和SAMR1海马的正反向抑制消减cDNA文库的构建,为进一步筛选鉴定SAMR1和SAMP8海马差异表达基因提供了丰富的实验材料。     

受褐飞虱取食的水稻幼苗的抑制消减cDNA文库的构建及筛选

采用抑制消减杂交方法,以褐飞虱取食32h的水稻幼苗及未受褐飞虱取食的水稻幼苗为作为对比材料构建了消减cDNA文库,以分离水稻幼苗中褐飞虱应答基因。随机从消减cDNA文库中挑选16个白色菌落提取质粒,进行PCR扩增,发现插入片段的长度位于100～900bp之间。以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的基因(BpHi008A)为探针,通过斑点印迹分析发现在抑制消减后的cDNA池中,目的基因得到有效富集。利用反向总RNA斑点印迹分析和Northern杂交验证,从消减cDNA文库中筛选到了25个基因受褐飞虱取食的诱导。其中有17个克隆与编码已知功能蛋白的基因有显著的同源性,它们分别参与蛋白质的折叠与降解、蛋白质与蛋白质的相互作用及信号传递、脂类代谢、胁迫反应、物质运输和细胞生长等。总体上,参与胁迫反应和衰老的基因在褐飞虱取食后表达增强。     

家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

旨在对EST筛选得到的家蝇伴侣蛋白TCP-1(MD-TCPⅠ)基因进行序列分析,克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中诱导表达。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MD-TCPⅠ基因,对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增,以pET-28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果显示,MD-TCPⅠ基因ORF全长753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量27.07 kD;等电点5.92,该序列编码的蛋白属于热休克蛋白60家族的TCP。构建了正确基因序列MD-TCPⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。     

红曲菌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的cDNA消减文库.分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取mRNA,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成大小为250～750bp的片断,将产桔霉素的cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到283个克隆,经PCR法快速测定,均得到250～750bp的插入片断.所构建的红曲菌cDNA消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础.     

条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

不同杀虫剂选育对家蝇抗药性水平及kdr基因频率的影响

采用杀虫剂（溴氰菊酯和甲基嘧啶磷）筛选及不接触药物自然衰退的方法,研究了家蝇Musca domestica氯氟氰菊酯高抗品系(Cyh-R)对杀虫剂的抗性变化,探讨蝇类抗药性治理的方法。用点滴法测定氯氟氰菊酯对不同家蝇品系的毒力,比较抗药性的变化,结合特异性等位基因PCR扩增（PASA）技术检测了不同家蝇品系的kdr基因频率,探讨kdr基因频率与抗性水平之间的关系。结果表明:甲基嘧啶磷筛选后,氯氟氰菊酯对第2~8代Cyh-R品系的LD₅₀呈递减趋势,从F₀的2.8434 μg/蝇降为F₈的0.4404 μg/蝇,但第8~18代Cyh-R品系的LD₅₀呈逐代递增趋势;溴氰菊酯筛选后,氯氟氰菊酯对Cyh-R品系第2~16代的LD₅₀呈上升趋势,从F₀的2.8434 μg/蝇升至F₁₆的24.3249 μg/蝇;表明了施用有机磷杀虫剂可降低其对氯氟氰菊酯的抗药性,而施用拟除虫菊酯药剂则有助于其对氯氟氰菊酯抗药性的增长;不使用任何杀虫剂也能降低其对氯氟氰菊酯的抗药性,但下降速率低于甲基嘧啶磷。PASA技术检测表明Cyh-R品系的kdr抗性基因频率为88.8%,不经过任何药剂筛选其kdr抗性基因频率下降程度最大,达到69.7%;甲基嘧啶磷筛选后其结果降为78.8%,而经溴氰菊酯筛选后kdr抗性基因频率则明显升高,达到98.9%。通过对kdr抗性基因频率和抗性水平进行相关和回归分析表明kdr抗性基因频率与家蝇对氯氟氰菊酯的LD₅₀呈对数关系,即LD₅₀值高的品系其kdr抗性基因频率相应的也较高。建议在家蝇防治中考虑轮换用药。     

三种内寄生蜂寄生对小菜蛾幼虫精子发生的影响

内寄生蜂寄生可能会引起寄主的寄生性去势。对小菜蛾Plutella xylostella与菜蛾啮小蜂Oomyzus sokolowskii Kurdumov (膜翅目： 姬小蜂科)、半闭弯尾姬蜂Diadegma semiclausum Hellén (膜翅目： 姬蜂科)、菜蛾盘绒茧蜂Cotesia plutellae (Kurdj.) (膜翅目： 茧蜂科) 3个寄生体系,利用形态学方法和蛋白质技术,研究了寄生对小菜蛾幼虫精子发生的影响。结果表明：菜蛾啮小蜂寄生对寄主的精子发生过程没有影响。半闭弯尾姬蜂寄生造成寄主精母细胞的细胞核畸形,精细胞的染色质超浓缩并趋向核膜,但能形成少量的精子;半闭弯尾姬蜂寄生会导致寄主精巢总蛋白的含量显著下降。菜蛾盘绒茧蜂寄生对小菜蛾幼虫精子发生的抑制程度最强,被寄生寄主的精母细胞出现肿胀,核膜皱缩,胞质中的线粒体发生病变;精细胞的染色体也出现超浓缩并趋向核膜,大量的精子溶解,无正常的精子形成;其精巢总蛋白含量的下降程度比姬蜂寄生的更为明显,且导致分子量为63.4 kD的主蛋白缺失。     

虫酰肼及其衍生物0593对家蚕的毒性及作用机理

为明确虫酰肼衍生物0593对家蚕Bombyx mori的毒性,本研究采用食下毒叶法测定了虫酰肼及其衍生物0593对家蚕的毒性,观察了亚致死浓度下对家蚕生长发育的影响,并测定了虫酰肼及其衍生物0593对家蚕幼虫体内保护酶的影响,对虫酰肼0593的作用机理进行了初步探索。结果表明：虫酰肼及其衍生物0593对2龄家蚕96 h的LC₅₀值分别为1.2863和0.3364 mg·L^-1,属高毒级药剂;虫酰肼及其衍生物0593在亚致死剂量下对家蚕的生长发育有明显的不利性,可使幼虫历期缩短0.5～2 d;处理组眠期体重、全茧量、蛹重和化蛹率与对照相比均显著降低;对4龄幼虫体内多酚氧化酶和几丁质酶也有较明显影响,虫酰肼及其衍生物0593处理家蚕,处理后6 h对体内多酚氧化酶有明显激活作用,12 h后表现出显著的抑制作用;虫酰肼及其衍生物0593对家蚕体内几丁质酶均有激活作用。0593对保护酶的影响较虫酰肼明显。结果提示虫酰肼及其衍生物0593对家蚕毒性高,对其生长发育和保护酶类均有不利性,不适合在桑园及其周边农田使用。     

云斑车蝗线粒体基因组全序列测定与分析

采用长距 PCR 扩增及保守引物步移法并结合克隆测序测定并注释了云斑车蝗 Gastrimargus marmoratus （Thunberg）的线粒体基因组全序列。结果表明：云斑车蝗线粒体基因组全序列为15 904 bp（GenBank登录号为EU527334）,A+T含量略高于非洲飞蝗Locusta migratoria,为76.04%,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA 基因,2个rRNA基因和一段1 057 bp的A+T富集区。蛋白质基因的起始密码子中,除COⅠ和ND5为TTG以外,均为昆虫典型的起始密码子ATN。ND5基因使用了不完全终止密码子T,其余基因均为典型的TAA或TAG。预测了22个tRNA基因的二级结构,发现tRNA^Ser（AGN）缺少DHU臂, tRNA^Ser（UGY）的反密码子环上有9个碱基。预测了云斑车蝗12S和16S rRNA二级结构,分别包括3个结构域30个茎环和6个结构域44个茎环。A+T富集区含有3个串联重复序列。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊的毒力及几种酶系的影响

采用药膜法测试了脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊Periplaneta americana初孵若虫的触杀活性,并测定了其对成虫中枢神经系统乙酰胆碱酯酶（AChE）和腺苷三磷酸酶(ATPase)离体活性的影响。结果表明：脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊初孵若虫具有较强的毒杀活性,在接触时间24、48、72和96 h 的LC₅₀分别为26.26、4.68、1.51和0.62 μg/cm²;其对AChE没有明显影响; 对Na⁺ -K⁺ -ATPase有明显抑制作用,并存在浓度 效应关系,IC₅₀为44.9 μmol/L; 对Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase表现出低剂量激活,高剂量抑制的现象。结果提示美洲大蠊的AChE不是脱氧鬼臼毒素靶标,而ATPase可能是脱氧鬼臼毒素的重要靶标之一。     

中华蜜蜂信息素结合蛋白ASP1 cDNA的克隆及时空表达

信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）在昆虫信息素的识别、传递和处理过程中具有重要作用。本研究首次克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana的一个PBP基因Ac-ASP1（GenBank序列号为DQ449670）,其预测蛋白具有典型的气味结合蛋白（OBPs）标志（即成熟肽含有6个保守的半胱氨酸）。利用real-time PCR技术对Ac-ASP1在中蜂不同组织和发育历期的时空表达谱进行了鉴定。绝对定量结果显示Ac-ASP1高丰度地表达于工蜂触角（2.07×10⁶ 拷贝数/μg）,而在其他组织（如头、胸、腹、翅及足）中呈低丰度表达（10²拷贝数/μg）; 相对定量结果显示Ac-ASP1在各发育历期如幼虫、蛹以及成虫发育早期（1～6日龄）均有大量表达,而在21日龄前后具有另外一个高丰度表达时期。这些结果可为明确Ac-ASP1在中蜂蜂王信息素信号识别传递过程中的作用提供参考。     

自同安钮夜蛾幼虫分离的一种核型多角体病毒

对在林间导致同安钮夜蛾Anua indiscriminate Moore幼虫死亡的一种病原物进行了分离和鉴定,并对该病原物进行了室内毒力测定。结果表明：该病原物为核型多角体病毒, 定名为同安钮夜蛾核型多角体病毒(AiNPV)。其对同安钮夜蛾幼虫的致死浓度LC₅₀和LC₉₀分别为3.4×10⁴和3.8×10⁷ PIB/mL。     

两近缘种烟草上棉铃虫种群适合度的比较研究

分别在室内和自然条件下,比较研究了普通烟草和黄花烟草两种不同寄主植物上棉铃虫生长发育、食物转化和利用及种群增长情况。结果表明： (1) 室内26±1℃、75%±5% RH和16L∶8D光周期条件下,与普通烟草相比,黄花烟草上幼虫的发育历期显著延长,1龄和2龄幼虫的存活率及雌蛾产卵量显著下降,种群净增殖率（R₀=30.5374）和内禀增长率（r_m=0.0951）减小;(2) 6龄幼虫对两种烟草的近似消化率及其相对生长率无显著差异,但对黄花烟草的利用率和转化率显著下降,相对取食量显著提高;(3) 第2代棉铃虫在普通烟田的种群增长（I=1.9922>1）比黄花烟田（I=1.1581>1）快,“烟草和其他”对种群起主要控制作用,特别是对低龄幼虫;第3代棉铃虫在普通烟田的种群增长有所减慢但仍呈上升趋势（I=1.5994>1）,而在黄花烟田则呈下降趋势（I=0.6434<1）,低龄幼虫受烟草抗性和雨水等的影响较大,高龄幼虫被病菌感染的数量增多。这些结果表明,与普通烟草相比,黄花烟草不适合棉铃虫种群的增长和繁殖。